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逆转录反应建立 - 7个关键注意事项
逆转录反应建立
对于分子生物学实验，逆转录主要用于生成代表组织或细胞特异性RNA群体的互补DNA（cDNA）。为使实验成功，需要考虑一些与模板、试剂和反应条件相关的关键注意事项。
Video: Simplified reverse transcription
Learn how reverse transcription works and how to select the right reverse transcriptases and primers for your experiment.
RNA模板制备
RNA是逆转录的模板。总RNA通常用于RT-(q)PCR等下游应用的cDNA合成，而特定类型的RNA（例如，信使RNA（mRNA），miRNA等小RNA）可经过富集而用于某些应用，如cDNA文库构建和miRNA图谱分析。
维护RNA完整性至关重要，在提取、处理、储存和实验使用过程中需要采取特殊的保护措施。防止RNA降解的最佳方法包括佩戴手套、使用具有气溶胶屏障的移液管移液、使用无核酸酶的实验室器具和试剂以及对工作区域进行去污处理。
根据来源材料（如血液、组织、细胞、植物）的类型和实验目标，有多种RNA分离和纯化方法可供选择。分离工作流程的主要目标是稳定RNA分子、抑制RNA酶，并通过适当的储存和提取方法最大程度提高产量。最佳的纯化方法可以去除干扰酶活性的内源性化合物，如植物组织中的复合多糖和腐殖酸，以及逆转录酶的常见抑制剂，如盐、金属离子、乙醇和苯酚。纯化的RNA应保存在-80°C，尽量减少反复冻融。
Video: Inhibitors in reverse transcription reaction
Learn about reverse transcriptase inhibitors, their inhibitory mechanisms, and tips on overcoming inhibitors in reverse transcription.
纯化后评估RNA质量和数量的方法有许多种。常用的方法是利用紫外光谱法检测特定波长的吸光度。RNA质量可通过利用Beer-Lambert定律测定260 nm处的吸光度而确定；不同波长的吸光度比值可以确定是否存在特定污染物（表1）。请注意，紫外吸光度不是RNA特有的，所有核酸都可以吸收相近波长的紫外线。对于需要更高RNA特异和更灵敏分析的RNA, 可以考虑使用含染料的荧光试剂，这种试剂只在特异性的与目标分子结合时才会释放荧光信号。
Video: What is a purity ratio?
Learn about determining sample purity by absorbance and calculating A260/A280 ratios.
表1. RNA分析的紫外检测指南
| 吸光度 | 表明存在： | 目标比值 |
|---|---|---|
| 230 nm | 有机化合物，糖，尿素，盐 | A260/A230 > 1.8 |
| 260 nm | 所有核酸 | A260 ≈ 0.1–1.0 |
| 270 nm | 苯酚 | A260/ A 270 > 1.0 |
| 280 nm | 蛋白质 | RNA: A260/A280 ≈ 2.0 DNA: A260/A280 ≈ 1.8 |
| 330 nm | 光散射 | A330 = 0 |
以28S和18S核糖体RNA（rRNA）的比值代表总RNA，可评估RNA的完整性。总RNA经过变性，并利用凝胶电泳按照分子量大小进行分离，可对其进行定性评估。然后，评估28S rRNA与18S rRNA的强度比，比值为2:1代表完整的RNA（图1A）。Agilent Technologies开发的一种方法结合了微流体学和专利算法，可定量评估RNA的完整性。该方法可产生数字读数，称为RNA完整性分数或RIN，数值介于8至10之间代表高质量的RNA [1,2]（图1B）。
图1. 利用（A）凝胶电泳和（B）微流体学方法进行RNA完整性分析。
基因组DNA去除
有些情况下，痕量基因组DNA（gDNA）可能与RNA共同被纯化。污染性gDNA可能会干扰逆转录，并导致RT-qPCR等灵敏性应用出现假阳性、高背景或检测率降低。
为去除gDNA，通常在RNA分离过程中加入DNase I。在进行RT-PCR之前，必须完全去除DNase I，因为任何残留的酶都会使单链DNA（如引物和合成cDNA）降解。通常，DNase I失活（如，EDTA和加热处理）或酶去除步骤会导致RNA降解或样品损失。
作为DNase I的替代品，可使用双链特异性Dnase去除污染性gDNA，而不影响RNA或单链DNA。它们的热分解性质使其在相对温和的温度（如55℃）下即可失活，同时没有负面影响。在逆转录反应之前，可以将这种双链特异性热分解DNase与RNA在37℃下孵育2分钟，从而简化工作流程（图2）。
图2. gDNA去除步骤：DNase I与Invitrogen™ ezDNase™酶。与DNase I相比，ezDNase酶具有更短的工作流程、简单的处理步骤和较少的RNA损伤。可选择在逆转录前使ezDNase酶失活，因为酶不会切割引物、ssRNA或cDNA:RNA复合物。
逆转录酶因素
逆转录酶以RNA为模板合成互补DNA，但这一类逆转录酶可能具有不同的功能活性和性质。它们的性质会影响其逆转录长RNA转录物、富含GC的RNA、具有明显二级结构的RNA和次优质RNA的能力。
分子生物学中使用的大多数逆转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒（AMV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的pol基因。 AMV逆转录酶是实验室中首批用于cDNA合成的酶之一。该酶是一种分子量为170-kDa的异二聚体，最佳反应温度范围为42-48℃。 AMV逆转录酶具有较强的RNase H活性，可降解RNA:cDNA复合物中的RNA，产生较短的cDNA片段（<5 kb）。
MMLV逆转录酶因具有单体结构而成为常用的替代品，可对重组酶进行更简单的克隆和修饰。MMLV逆转录酶是一种分子量为75 kDa的酶，反应温度约为37°C。虽然MMLV的热稳定性低于AMV逆转录酶，但其RNA酶H活性较低，因此具有更高的长cDNA（<7kb）合成效率[3]。
为了进一步改善cDNA合成，MMLV逆转录酶经过改良具有更低的RNase H活性（即突变的RNA酶H结构域或RNase H–）、更高的热稳定性（高达55℃）和更强的持续合成能力（65倍以上）。这些属性可增加cDNA长度和产量，提高灵敏性，改善抑制剂耐受性，并缩短反应时间（表2）[4]。（了解更多：逆转录酶属性）
表2. 常用逆转录酶及其属性
| AMV逆转录酶 | MMLV逆转录酶 | 改良型MMLV逆转录酶 （如，Invitrogen™ SuperScript™ IV逆转录酶） | |
|---|---|---|---|
| RNase H活性 | 高 | 中 | 低 |
| 反应温度 （推荐最高温度） | 42°C | 37°C | 55°C |
| 反应时间 | 60 min | 60 min | 10 min |
| 目标长度 | ≤5 kb | ≤7 kb | ≤12 kb |
| 相对产量 （使用困难或次优质RNA） | 中 | 低 | 高 |
引物选择
为了启动逆转录，逆转录酶需要一种短DNA寡核苷酸（即引物）与其互补序列在RNA模板上结合，并作为新链合成的起点。根据RNA模板和下游应用，有三种基本类型的引物可供选用：oligo（dT）引物、随机引物和基因特异性引物（图3）。
图3. 逆转录中的常用引物。
Oligo（dT）引物由12-18个脱氧胸腺核苷酸组成，与真核mRNA的poly(A) 尾部退火，仅占总RNA的1-5％。这些引物是从真核mRNA构建cDNA文库、全长cDNA克隆和cDNA末端3'快速扩增（3'RACE）的最佳选择。由于oligo(dT)引物对poly(A) 尾部的特异性，它们不适用于降解RNA，如来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品的RNA，也不适用于缺少poly(A) 尾部的RNA，如原核RNA和microRNA。由于cDNA合成开始于3' poly（A）尾部，oligo(dT)引物可能引起3'末端偏差。具有明显二级结构的RNA也可能破坏全长cDNA合成，导致5'末端的代表性降低。
通过修饰Oligo(dT)引物，可以提高逆转录效率。例如，Oligo(dT)引物的长度可以延伸到20个核苷酸或更长，使其在较高温度的逆转录反应中退火。在一些情况下，Oligo(dT)引物可能包括3'末端的多义碱基，如dN（dA，dT，dG或dC）和dV（dG，dA或dC）。该修饰可防止poly(A)滑移，并且将起始位点锁定在poly(A)尾部的上游位置。这些引物被称为锚定oligo(dT)。
随机引物是具有随机碱基序列的寡核苷酸。它们通常由6个核苷酸组成，被称为随机六聚体、N6或dN6。由于随机引物的随机结合（即没有模板特异性），其可以退火到样品中的任何RNA种类。因此，这些引物被认为可以用于无poly（A）尾部结构（如Rrna、Trna、非编码RNA、小RNA、原核mRNA）的RNA、降解RNA（如，来自FFPE组织的RNA）和具有已知二级结构的RNA（如，病毒基因组）的逆转录。
虽然随机引物有助于改善cDNA合成，但它们不适用于长RNA的全长逆转录。增加逆转录反应中的随机六聚体浓度，可提高cDNA产量，但同时也会增加相同模板上多个位点的结合，从而导致cDNA片段较短（图4）。
此外，仅使用随机引物可能不适用于某些RT-PCR应用。例如，高估mRNA拷贝数就是一个需要考虑的问题[5]。两步法RT-PCR经常使用oligo(dT)和随机引物的混合物，从而保障所有引物类型的效果。在microRNA（miRNA）表达测定中，随机六聚体并不适用，必须为miRNA的逆转录设计特殊引物[6,7]。
图4. cDNA长度和产量受引物选择和浓度的影响。使用oligo (dT)引物或不同浓度的随机六聚体，将具有poly(A)尾部结构的6.4-kb RNA逆转录成双链（ds）cDNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。使用oligo（dT）引物可产生更分散、更长的转录产物，相比之下，增加随机六聚体的浓度，可产生更高浓度的短cDNA
- 基因特异性引物可提供特异性最强的逆转录引物配对。这些引物是根据目标RNA的已知序列进行设计的。由于引物与特异性RNA序列结合，每个目标RNA都需要一套新的基因特异性引物。因此，对多种目标RNA的分析需要使用更多的RNA。基因特异性引物通常可用于一步RT-PCR应用。
表3. 常用逆转录引物的对比
| Oligo(dT) | 随机六聚体 | Oligo(dT)+ 随机六聚体 | 基因特异性引物 | |
|---|---|---|---|---|
| 标准终浓度 | 2–5 µM | 2–5 µM | 每个1–2 µM | 0.5–1 µM |
| 在25°C预先引物延伸 | — | — | ||
| 主要优势 | 具有poly(A)尾部结构的RNA的全长逆转录 | 大多数RNA种类的逆转录，包括降解RNA | oligo(dT)和随机引物的综合优势 | 目标基因的特异性逆转录 |
主要反应组分
除酶和引物之外，逆转录的主要反应组分还包括RNA模板（预处理以去除基因组DNA）、缓冲液、dNTP、DTT、RNase抑制剂和无RNase水（图5）。
图5. 逆转录反应及其主要组分。
- RNA模板按前述方法制备。表4提供了逆转录反应的推荐RNA输入量范围，最佳输入量取决于目标序列的普遍性和逆转录酶的灵敏性。
表4. 逆转录反应的推荐RNA输入量范围
| RNA模板 | 推荐范围 |
|---|---|
| 总RNA | 10 pg–5 μg |
| Poly(A) RNA | 10 pg–0.5 μg |
| 特殊RNA | 0.01 pg–0.5 μg |
- 反应缓冲液可维持反应的最佳pH和离子强度。提供的缓冲液还可能含有提高逆转录效率的添加剂。
- dNTPs通常为0.5-1 mM，最好为等摩尔浓度。推荐使用新鲜稀释的高品质dNTP，以确保良好的逆转录。
- DTT，一种还原剂，通常用于提供最佳的酶活性。 如果DTT或其他添加剂发生沉淀，会降低反应效率；因此，应溶解反应组分并充分混匀。
- RNA酶抑制剂通常包含在反应缓冲液中或被加到逆转录反应中，用于防止RNA降解。RNA酶可能在分离过程中被共同纯化，或者在反应建立期间被引入。已知的RNA酶有许多种，应根据其作用方式和反应要求选择合适的RNA酶抑制剂。
- 逆转录反应中使用的水应不含有核酸酶。最好选用商业来源的无核酸酶水，或经DEPC（焦碳酸二乙酯）处理去除RNA酶的水。污染了RNA酶不能通过简单的过滤去除，而且由于RNA酶是热稳定的，无法通过高压消毒去除。
反应温度和时间因素
逆转录反应包含三个主要步骤：引物退火、DNA聚合和酶失活（图6）。这些步骤的温度和持续时间因引物选择、目标RNA和使用的逆转录酶而异。
图6. cDNA合成的三个主要步骤。
- 引物退火：将引物与RNA模板混合，加热至65℃并维持5分钟，然后冰浴至少1分钟。这有助于确保RNA保持单链以及引物与靶标有效退火。退火后，加入逆转录酶和必需组分（如缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂）。
- DNA聚合：在此步骤中，反应温度和持续时间可能会根据引物选择和所用的逆转录酶而变化。使用oligo (dT)引物（Tm〜35-50℃），可以在逆转录酶的最佳反应温度（37-50℃）下直接孵育反应。随机六聚体因其较短的长度，通常具有较低的Tm（〜10-15℃）。 因此，当使用随机六聚体（单独或与oligo（dT）组合）时，我们建议在加入酶后，在室温（〜25℃）孵育逆转录反应10分钟以延伸引物。
逆转录酶的热稳定性各不相同，而热稳定性决定了每种酶的最佳聚合温度。使用热稳定的逆转录酶，可达到更高的反应温度（如50℃），帮助富含GC或具有二级结构的RNA变性，同时不影响酶活性（图7）。使用这种酶，可通过高温孵育增加cDNA产量、长度和代表性。
聚合时间取决于逆转录酶的持续合成能力，即单次聚合过程中掺入的核苷酸数量。例如，持续合成能力较低的野生型MMLV逆转录酶通常需要60多分钟才能合成cDNA。相比之下，持续合成能力较高的改良型逆转录酶可能只需要10分钟时间，就可以合成9kb cDNA（了解更多关于逆转录酶持续合成能力的信息）。
图7.热稳定性及其对逆转录酶活性的影响。使用oligo（dT）引物和放射性标记dNTPs，对含有不同长度RNA的样品进行逆转录。通过凝胶电泳分离反应产物，并通过放射自显影进行显色。热稳定的逆转录酶即使在50℃以上也能得到高cDNA产量。
Reverse transcription in 10 minutes
Learn how reverse transcription can be achieved in 10 minutes using a highly processive reverse transcriptase.
- 酶失活：逆转录反应的最后一步是使逆转录酶失活。失活温度范围为70-85℃，具体取决于酶的热稳定性。失活通常需要5-15分钟，温度越高，所需时间越短。
第一链和第二链cDNA合成
如前所述，从RNA模板合成cDNA，产生cDNA:RNA复合物。该过程被称为第一链cDNA合成。如果存在RNase H活性（如野生型AMV和MMLV逆转录酶），则cDNA:RNA复合物中的RNA会在第一链合成期间被切割。第一链cDNA（结合或不结合退火RNA）可以直接用于RT-PCR等应用中，而热稳定的DNA聚合酶（如，Taq DNA聚合酶）将复制cDNA的互补链。
在cDNA文库构建和测序中，第一链cDNA作为模板，生成代表RNA靶标的双链cDNA。这个过程被称为第二链cDNA合成。在第二链cDNA合成中，推荐使用RNA酶H活性最小的逆转录酶，从而最大限度地增加cDNA长度和产量。
双链cDNA的合成通常使用不同的DNA聚合酶（如T7DNA聚合酶、DNA聚合酶I、Taq DNA聚合酶），生成cDNA第一链的互补链。其他的酶可用于双链cDNA合成，例如下图中的Gubler-Hoffman改良方法[8]（图8）。
图8.利用Gubler-Hoffman方法进行双链cDNA合成。
- 大肠杆菌RNase H切割cDNA:RNA复合物中的RNA链，为DNA合成提供3'-OH引物结合位点
- 大肠杆菌DNA聚合酶I利用5′-3′'聚合酶活性延伸切口RNA链，并利用5'-3'外切核酸酶活性沿合成方向替换RNA链，该过程被称为切口平移。
- 大肠杆菌DNA连接酶缝合新合成cDNA片段之间的切口。（T4 DNA连接酶不能用作替代物，因为它会连接钝端双链cDNA片段并形成嵌合结构。）
- T4 DNA聚合酶钝化双链cDNA的末端（在最后一步中可选）。
总之，逆转录的成功高度依赖于反应组分和条件。应正确进行反应，使其满足目标下游应用的需要。
参考文献
- Schroeder A, Mueller O, Stocker S et al. (2006) The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Mol Biol 7:3.
- Mueller O, Lightfoot S, Schroeder A (2016) RNA Integrity Number (RIN) – Standardization of RNA Quality Control. Agilent Technologies Publication 5989-1165EN.
- Invitrogen Corp. (2002) High performance RT for reliability in every experiment. (Brochure)
- Thermo Fisher Scientific (2015) SuperScript IV Reverse Transcriptase. (White paper)
- Zhang J, Byrne CD (1999) Differential priming of RNA templates during cDNA synthesis markedly affects both accuracy and reproducibility of quantitative competitive reverse-transcriptase PCR. Biochem J 337 (Pt 2):231–241.
- Chen C, Ridzon DA, Broomer AJ et al. (2005) Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res 33(20):e179.
- Kramer MF (2011) Stem-loop RT-qPCR for miRNAs. Curr Protoc Mol Biol Unit 15.10.
- Gubler U, Hoffman BJ (1983) A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene 25(2-3):263-269.
仅供科研使用，不可用于诊断目的。