反转录——六种最常见的应用

RT-qPCR 最常见应用之一是测定 mRNA 水平随时间、空间或特殊处理后 (如药物处理) 的变化。由于 RT-qPCR 的灵敏度高于 RT-PCR ， RT-qPCR 也广泛用于检测是否存在逆转录病毒 (RNA 病毒)。与 RT-PCR 实验流程类似， RNA 首先转化为 cDNA ，然后通过 PCR 扩增。主要的区别在于，在指数扩增阶段，RT-qPCR 是通过荧光实时检测 cDNA 扩增的水平。此扩增水平作为对 RNA 中初始靶标进行定量的基准。

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博文：了解实时荧光定量 PCR 中的 C_t 值

通过 RT-qPCR 进行基因表达定量检测的准确性在很大程度上取决于 cDNA 模板的质量和数量。因此，反转录步骤对于 RT-qPCR 的成功至关重要。反转录步骤应产生能代表初始 RNA 的 cDNA 产物。因此，所选择的反转录酶应该具有高效合成 cDNA 的能力，即使对于低丰度基因和纯度不佳或复杂 RNA 样本 (如高 GC 含量、含抑制剂、降解样本) 。

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应用说明： 针对植物样本改进的 RT-qPCR 分析
应用说明： 针对全血 RNA 样本改进的 RT-qPCR 分析

除了高效的反转录酶外，选择用于 RT 反应的试剂时还有许多考虑因素。首先，在较宽的起始量 RNA 范围内，cDNA 的动态范围或线性扩增至关重要。获取与起始 RNA 量成比例 cDNA 产量的能力可确保对基因表达的准确定量分析（图2）。

白皮书： 改进型反转录酶

图2.在一系列不同起始量总 RNA，使用 RT 预混液扩增后 qPCR 结果的线性度，用于检测 (A) 高丰度和 (B) 低丰度 RNA 靶标。RNA 起始量从 10 μg 到 1 μg ，经反转录，随后通过 PCR 扩增。两种预混液均生成与 RNA 上样 _{量成比例的 cDNA}，但如较低 (即早期) CT 值所示，从预混液 1 中获得更高的产量，尤其是对于低丰度基因靶标。

此外，所选的试剂应能在重复实验中获得大量且一致的 cDNA 得率，以获得灵敏度高且差异性小的基因表达结果 (图 3)。含有反转录所需所有成分的单管预混液有助于尽可能减少实验变量、交叉污染和移液失误。

白皮书： 经优化的 RT-qPCR 预混液

图3.使用不同 RT 预混液后 qPCR 结果的灵敏度和变异性，用于检测 (A) 高丰度和 (B) 低丰度 RNA 靶标。在这些试剂中， 30 次重复实验后，预混液 1 的平均 值和标准偏差最低，说明反转录试剂的选择对进行可靠基因表达分析的重要性。

一种特殊的 RT-qPCR 是直接从粗细胞裂解物中进行反转录，而无需分离 RNA [1]。在研究少量细胞的实验中，使用稀缺的样或选择特定细胞时，可考虑进行直接 RT-qPCR 以防止潜在样本损失和低 RNA 回收率。在直接 RT-qPCR 中，抑制内源性 RNase（其可降解 RNA）和在细胞裂解过程中去除细胞基因组 DNA 非常重要。使用针对低丰度靶标而优化的试剂盒，样品制备可以在短短 7 分钟内完成，同时可从。 具有高持续合成能力的反 转录酶尤其适用于对未纯化 RNA 提取物的反转录，因为其具有对抑制剂较高的耐受性和高灵敏度。

分子生物学中反转录酶最高的应用之一就是构建 cDNA 文库 [2 – 4]。cDNA 文库由代表特定样本中转录序列的 cDNA 克隆组成。因此，文库可提供针对特定细胞类型、器官或发育阶段基因的时间和空间表达信息。cDNA 文库克隆用于新型 RNA 转录本的表征、基因序列测定和重组蛋白的表达。

构建 cDNA 文库的关键在于是否能对 RNA 全长和相对丰度的合理表征，因此反转录酶的选择非常重要。具有高持续合成能力的反转录酶可合成全长 cDNA 并捕获低丰度 RNA。同样，具有高热稳定性的反转录酶推荐用于含复杂二级结构 RNA 的逆转录。

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白皮书： 改进型反转录酶

反转录后，可使用多种方法将 cDNA 插入 载体 中以进行克隆。第二链 cDNA 合成 后的双链 cDNA 通常是平末端，可直接克隆进入平末端载体 (图 4A)。尽管这种方法涉及的步骤更少，但平末端克隆可能连接效率较低且插入后失去方向性。

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或者，可以对 cDNA 末端进行修饰，以包括已知序列的其他核苷酸。例如，为修饰 cDNA 的 5′ 末端，可以使用具有额外 5′ 核苷酸的oligo(dT) 引物来启动反转录；为修饰 cDNA 的 3′ 末端，可以连接具有所需序列的短 DNA 寡核苷酸，又称为 linker 或 adapter (图 4B)。通过这种方式，定向插入（例如限制性和同源重组）、启动子结合（例如 T3 和 T7 序列）和亲和纯化（例如生物素和 His 标签）的位点可以很容易地掺入 cDNA 序列中。

图4.克隆 cDNA 的常用方法。(A) 具有平末端的双链 cDNA 可直接克隆到平末端克隆载体中。(B) 对于定向克隆， cDNA 末端可使用与载体兼容的独特序列进行修饰。(C) 可使用互补的末端序列进行不依赖连接酶的克隆，以提高插入效率。(D) 当插入片段的序列已知时，可考虑通过 PCR 进行基因特异性克隆。

在另一种常用策略中，可以使用互补同聚物加尾对 cDNA 插入片段和载体的 3′ 末端进行酶促延伸。使用 末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 和单一 dNTP，可以在插入片段上添加一串含 20 – 30 个核苷酸的序列，并将一串相似的互补核苷酸添加到载体上 (如插入片段上的 Cs 和载体上的 GS) ，使载体和插入片段尾部相互退火 (图 4C)。在细菌，因此无需连接步骤。

若目标序列是已知的，可通过 RT-PCR 生成插入片段，用于克隆 cDNA的特定区域 (图 4D)。

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cDNA 末端快速扩增 (RACE) 是一种基于 PCR 的方法，可用于确定 cDNA 5′ 和 3′ 末端的未知序列 [5]。这些方法通常被称为 5′ RACE 和 3′ RACE。RACE 的实验目的包括鉴定 5′ 和 3′ 非翻译区，研究异质性转录起始位点，表征启动子区域，测定完整 cDNA 序列 ，以及对用于蛋白表达的完整开放阅读框 (ORF) 进行测序。

使用具有单侧特异性的 PCR (也称为单侧或锚定 PCR [6 ， 7]) 扩增 cDNA 的未知区域作为 RACE 产物。5′ RACE 依赖于带寡核苷酸的 5′ 末端延伸，用于 PCR 引物结合，而 3′ RACE 利用 mRNA 的 poly(A) 尾作为 PCR 的通用引物位点 (图 5)。

在 5′ RACE (图 5A) 中，使用基因特异性引物，将特定序列或相关家族的 mRNA 反转录为第一链 cDNA。然后使用 末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT)通在 cDNA 的 3′ 末端添加一个同聚物尾部结构 (通常是一串 Cs)，或将 cDNA 3′ 末端连接到寡核苷酸接头上。随后，进行两轮半嵌套 PCR，以扩增具有 5′ 未知序列的区域。还可使用下游应用的引物通过 PCR 对扩增子进行末端延伸，例如用于定向克隆的限制性位点引入和用于测序的通用测序引物结合位点。

在 3′ RACE (图 5B) 中，使用含接头序列的 oligo (dT) 引物将 mRNA 反转录为 cDNA。然后，使用已知上游外显子序列的特异性引物和通过 oligo (dT) 引物引入的接头序列，进行两轮半嵌套 PCR。通过这种方式，可对外显子和 poly(A) 尾之间的未知 3´ mRNA 序列进行扩增，以供进一步分析。

起始 RNA 的质量和反转录反应体系配制对于成功进行 RACE 实验至关重要。在 5′ RACE 中，任何长度 (甚至包括未达 mRNA 5′ 末端的产物) 的第一链 cDNA 都将具有添加序列 (即同聚物尾部结构或接头) ，随后通过 PCR 进行扩增。为了最大限度合成全长 cDNA ，应选择具有最小 RNase H 活性、高持续合成能力和高热稳定性的反转录酶。

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1990 年代期间，DNA 芯片的发展开启了大规模无偏差或先前假说的基因表达图谱分析。芯片由玻璃或硅晶片上数千个被称为“features”或“spots”的腔室组成。每个腔室的表面上固定有相同拷贝数的单链DNA序列，称为“探针”，每个探针代表一个基因。探针与用于芯片的荧光标记 cDNA 靶标杂交，可同时比较两个样品之间的基因表达 (图 6 和 7) [10-12]。

芯片探针由生物体已知基因组序列或 cDNA 生成。例如，可以利用 PCR 对每个已知基因进行扩增，然后将其产物变性为单链 DNA ，并将其固定到芯片上作为探针。或者，可直接在芯片上合成 20 – 60 nt 的寡核苷酸作为芯片探针 [13]。

图 7 概述了微阵列芯片如何用于不同基因的表达分析。首先，从两个实验样本（也称为“检测样本”或“处理样本）和对照样本（也称“参考样本”或“正常样本”）中分离总 RNA 或 mRNA。然后将纯化的 RNA 样本转化为 cDNA ，并使用不同的荧光染料进行标记。接下来，将两个样本的标记 cDNA 靶标混合，并与一个微阵列芯片上的探针杂交。洗去未结合的靶标后，扫描芯片以检测标记的荧光基团。然后分析两种荧光信号的比例，以定量测定受实验条件影响的基因的表达。

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cDNA 靶标可以在反转录过程中或反转录后进行标记 (图 8)。在直接标记中，在 cDNA 合成过程中即掺入荧光标记的核苷酸。在间接标记中，先使用已修饰的核苷酸进行反转录，然后用荧光基团标记 cDNA。尽管间接标记方法需要更长的实验流程，但荧光标记效率往往更高。

图8.直接和间接 cDNA 标记。

当 RNA 起始量较少 (如 10 – 100 ng) 时，可使用 T7- oligo (dT) 启动子引物将 RNA 反转录为双链 cDNA。然后通过体外转录 (图 9)。在体外转录过程中，可以使用修饰核苷酸直接或间接标记 RNA。或者，对扩增的 RNA 进行反转录并标记以生成 cDNA 靶标。

在选择用于制备基因芯片 cDNA 靶标的反转录酶时，可获取高产量全长 cDNA 的能力对于能否很好覆盖 RNA 整体至关重要 ，即使 RNA 序列具有高 GC 含量或二级结构。同样重要的是，为确保获得高信噪比，反转录酶必须能够有效地掺入修饰核苷酸，从而能够准确且无偏差地检测起始 RNA 。

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白皮书： 改进型反转录酶

RNA 测序，又称为 RNA-Seq， 通常可用于研究从基因组转录的 RNA 及其调控机制。随着二代测序 (NGS) 的出现， RNA-Seq 已成为分析全转录组 (即已转录的编码和长链非编码 RNA ) 、检测基因表达、发现剪接变异和融合转录本以及检测低丰度基因的高通量分析方法 [14,15] 。与基因芯片相比，RNA-Seq 的优点包括动态范围更大，灵敏度更高以及可在无基因组信息的情况下表征 RNA 序列。

由于大多数测序平台是为 DNA 设计的，因此 RNA-Seq 的模板制备需要进行反转录。最理想的结果是，所得到的 cDNA 能够无偏差代表初始 RNA，包括低丰度转录物。全长 cDNA 合成对于捕获样本中的所有 RNA 序列也非常重要。反转录的错误率也至关重要，这取决于测序文库大小和数据质量。因此，应谨慎认真选择反转录酶。

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研究目标和测序技术将决定 RNA-Seq 模板制备的顺序和方法 [16, 17]。尽管如此，典型的测序文库建库流程包括目标 RNA 的富集、RNA 或 cDNA 的片段化、 反转录 、测序接头 (在多重测序中，还需添加索引或条形码） 以及可选的 文库 PCR 扩增 (图 10)。

图10.RNA 测序的传统实验流程。

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RT-LAMP 是一种快速、简单、灵敏的 RNA 检测方案，可使用多种方法用来评估检测结果。由于其具有简单的工作流程和快速的反应时间，尤其适用于在实验室或现场环境中对病毒病原体的检测和监测。

LAMP 方法依赖于具有强链置换活性的 DNA 聚合酶、经特殊设计的内外引物以及环状引物。对于 RNA 靶标的扩增，只需将反转录酶和 RNase 抑制剂添加到 LAMP 反应 (RT-LAMP) 中即可进行一步反应。

LAMP 在恒定温度 (60 – 65°C) 下进行，被归类为等温扩增。LAMP 扩增技术需要 4 或 6 个特殊设计的引物，该引物可与两个不同的靶标区域结合 (相隔~300 bp)。LAMP 最初被开发时使用 4 个引物，随后添加两个环状引物使反应时间缩短了一半。目前，使用 LAMP 法可在 15 分钟内扩增靶标 RNA 或 DNA。LAMP 所需的引物包括两个外部 (F3 和 B3) 引物、两个内部引物 (正向内引物 (FIP) 和反向内引物 (BIP) 和环状引物（正向环状引物 (Loop F) 和反向环状引物 (Loop B)）。

LAMP 反应分两步进行：非循环步骤和自动循环步骤。第一步是内引物 (FIP) 与靶标 DNA 结合，开始互补链合成。之后紧接着是外引物 (F3) 的链侵入延伸，释放单链 DNA 作为下游引物的模板。转换得到的内部序列在 F 端形成一个茎环结构。在另一端借助 BIP 引物和 B3 引物进行同样的过程，最终获得在 3′ 和 5′ 端带有茎环的哑铃结构该结构包含多个用于重复扩增的起始位点，并通过自动循环加快了 DNA 扩增，从而得到不同长度和菜花样结构的扩增 DNA (图 11)。

• 不需要热循环仪 (仅需加热模块)
• 快速周转时间 (15-60 分钟)
• 多种方法解读检测结果
• 简化的工作流程
• 对抑制剂具有高耐受性
• 适合用于现场检测

RT-LAMP 仅需要少量 RNA，耐受反应抑制剂，易于操作，特异性和灵敏度高。等温条件下的扩增无需热循环仪，扩增效率更高，无需等待温度变化。由于这些特性， LAMP 技术自其发现以来其应用经历了指数级增长。RT-LAMP 在实验室中用于快速检测病原体 (细菌、寄生虫和病毒)。由于其简单性，它也是适应现场或床旁检测的重要方法。

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