染色质免疫沉淀ChIP实验-蛋白质核酸Pull-down产品-赛默飞

染色质免疫沉淀（ChIP）测定 是为了确定DNA结合蛋白（如转录因子和组蛋白）与基因组的结合区域。在 ChIP 测定中，与 DNA 结合的蛋白会暂时交联，DNA会在细胞裂解前被剪切。靶蛋白与交联核苷酸序列一起进行免疫沉淀，然后纯化 DNA 并通过 PCR 检测识别，进行测序和微阵列分析，或以其他方式进行分析。

RNA免疫沉淀（RIP） 使用的方法与ChIP类似，只是免疫沉淀的是RNA结合蛋白而不是DNA结合蛋白。免疫沉淀的RNA可以通过 RT-PCR 和 cDNA 测序进行鉴定。

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蛋白质-核酸pull-down ，特别是蛋白质-RNA pull-down，是以去硫生物素末端标记的RNA为诱饵，通过富集RNA结合蛋白来完成的。使用链霉亲和素磁珠可捕获核糖核蛋白复合物，使用生物素洗脱缓冲液可回收复合物。下游应用包括免疫印迹和质谱分析 (MS)。

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ChIP分析实验方案

染色质免疫沉淀测定（ChIP 测定）通过监测组蛋白修饰（表观遗传学）或转录因子与 DNA 结合相互作用的转录调控，确定基因组与蛋白质组之间的联系。ChIP 的优势在于能够捕捉系统中发生的特定蛋白质与 DNA 之间的相互作用，并利用定量聚合酶链反应 (qPCR) 对相互作用进行量化。

染色质免疫沉淀（ChIP）测定是一种强大的方法，可用于分析与特定调控蛋白结合的表观遗传修饰和基因组 DNA 序列。

染色质免疫沉淀实验需要多种蛋白质组学和分子生物学方法，包括交联、细胞裂解（蛋白质-DNA 提取）、核酸剪切、基于抗体的免疫沉淀、DNA 样品纯化和 PCR。在优化实验中，通常还会使用凝胶电泳等其他技术来验证特定步骤。

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Step 1交联
Step 2细胞裂解
Step 3染色质制备
Step 4免疫沉淀
Step 5解交联和 DNA 纯化
Step 6DNA 定量

染色质免疫沉淀（ChIP）测定首先要对蛋白质-DNA 复合物进行共价稳定。许多蛋白质-DNA 相互作用都是瞬时的，需要多蛋白复合物来协调生物功能。体内交联能共价稳定蛋白质-DNA 复合物。

体内交联传统上使用甲醛，但也可与 EGS 和 DSG 等其他交联剂结合使用。甲醛交联适用于直接相互作用的两个分子。然而，甲醛是一种零长度交联剂，限制了其功能性。对于更高阶的相互作用，较长的交联剂（例如 EGS（16.1Å）或 DSG（7.7 Å ）可以捕获具有复杂四级结构的较大蛋白质复合物。

研究人员常使用组合交联剂来捕获蛋白质-DNA 相互作用复合物。这些交联剂可直接渗透到细胞中，有效地将蛋白质-DNA 复合物锁定在一起，即使是瞬时相互作用复合物也能被捕获并稳定，以便进行分析。

裂解阶段从细胞或组织中提取并释放交联蛋白质-DNA 复合物。在这一阶段，通过去垢剂溶液去溶解细胞膜来释放细胞成分。由于蛋白质与 DNA 的相互作用主要发生在细胞核区域，去除胞浆蛋白有助于减少背景和提高灵敏度。去垢剂或盐的存在不会影响蛋白质-DNA 复合物，因为第一步共价交联已经稳定了复合物。

不建议对细胞进行机械裂解，因为它会导致无效细胞核裂解。Thermo Scientific Pierce 染色质制备模块等试剂可将细胞核与其他细胞成分分开，用于消除背景信号和提高灵敏度。

提取步骤会产生所有核物质，包括未结合核蛋白、全长染色质和交联蛋白质-DNA 复合物。为了分析蛋白质结合序列，必须将提取的基因组 DNA 剪切成较小的可操作片段。DNA 片段化通常通过超声以机械方式实现，或者通过微球菌核酸酶（MNase）以酶消化方式实现。

理想的染色质片段范围为 200 到 > 1000 bp，但是 DNA 剪切是最难控制的步骤之一。超声处理可提供随机化的碎片，但局限性包括可能需要专用机械设备、超声期间难以维持温度、操作时间延长以及需要大量优化步骤。用微球菌核酸酶进行酶消化具有很高的重现性，并且更适合处理多个样品，但由于酶活性的变化可能导致变异，并且这种酶对核小体间区域具有更高的亲和力。

为了分离特定修饰组蛋白、目标转录因子或辅助因子，使用经 ChIP 验证的抗体来免疫沉淀靶标蛋白，并将靶标蛋白与其他核成分分离。该步骤可选择性地富集感兴趣的目标蛋白-DNA 复合物，并剔除了所有其他无关的细胞物质。

选择合适的抗体是成功进行 ChIP 的关键之一。对于哺乳动物样品，有多种经验证的 ChIP 级抗体可用于此流程。对于无法获得合格抗体的靶蛋白，融合蛋白（例如，带HA、myc 或 GST标签）可在生物样品中表达，然后使用针对亲和标签的抗体对靶标蛋白进行免疫沉淀。

使用抗体结合树脂（例如固定的蛋白 A，蛋白 G 或蛋白 A/G）来亲和纯化抗体-蛋白-DNA 复合物。对于生物素化抗体，也可以使用固定的链霉亲和素或固定的 Thermo Scientific NeutrAvidin(中型亲和素)。为了降低背景，必须结合核酸和蛋白质封闭缓冲液（例如鲑鱼精子 DNA 和普通蛋白质源）来封闭抗体结合树脂。每个 ChIP 样品中使用的树脂量也会影响背景，因为填料量的增加可增加非特异性结合。

染色质免疫沉淀的目的是富集与目标蛋白质结合的 DNA。DNA 水平可以通过琼脂糖凝胶电泳或通过更常见的定量聚合酶链反应（qPCR）来确定。在扩增和测量染色质免疫沉淀的特异 DNA 序列之前，必须解开蛋白质和 DNA 之间的交联。这通常是通过大量温育或蛋白酶 K 消化蛋白质成分来实现的。

蛋白酶 K 可裂解脂肪族、芳香族或疏水性残基的羧基侧。由于蛋白酶 K 具有广泛的特异性，通常用于去除 DNA 或 RNA 样品中的蛋白质。此外，蛋白酶 K 还能消除纯化 DNA 中的核酸酶，从而防止降解。为了从蛋白质片段中分离 DNA，可将苯酚-氯仿与标准 DNA 纯化方法结合使用。或者，还可以使用专为从复杂生物样品中纯化核酸材料而设计的离心柱。