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蛋白交联
什么是蛋白交联？
交联剂 (也称为双功能交联剂) 是含有两个或更多反应性基团的试剂，这些反应基团通过间隔与蛋白或其他生物分子上的官能团共价连接。有三种类型的交联剂可供选择：同型双功能交联剂，异型双功能交联剂和光反应性交联剂。同型双功能交联 试剂具有相同的反应基团，主要是胺对胺或巯基对巯基。它们通常用于形成分子内交联或从单体中制备聚合物。异型双功能交联 试剂具有不同的反应基团，如胺对巯基，羧基对胺或巯基对羧基。它们可用于制备两种不同生物分子之间的偶联物。异型双功能交联试剂还包括在暴露于紫外光后与亲核试剂反应或形成 C-H 插入位点的光反应性交联试剂。了解有关交联试剂的更多信息。
使用我们的交 联剂选择工具 或从以下最常见的交联剂中选择适合您应用的交联试剂。
基于类型和反应化学的最常见交联剂
胺-胺
巯基 - 巯基
| 巯基 - 巯基交联剂 | 订购产品 | 间隔臂长（Å） | 可被剪切？ | 是否具有水溶性？ | 膜通透性？ |
|---|---|---|---|---|---|
| NHS- 马来酰亚胺 | SMCC | 8.3 | 不适用 | 否 | 是 |
| Sulfo-SMCC | 8.3 | 不适用 | 是 | 否 | |
| NHS-吡啶硫酚交联剂 | SPDP | 6.8 | 硫醇 | 否 | 是 |
| LC-SPDP | 15.7 | 硫醇 | 否 | 是 |
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同双功能交联。DSG是胺与胺交联剂，含有 NHS 酯反应性基团，位于短间隔臂的相对两端。同型双功能交联剂能够与两种分子同时进行反应。
胺-巯基
| 反应基团 | 订购产品 | 间隔臂长（Å） | 可被剪切？ | 是否具有水溶性？ | 膜通透性？ |
|---|---|---|---|---|---|
| NHS- 马来酰亚胺 | |||||
| SMCC | 8.3 | 不适用 | 否 | 是 | |
| Sulfo-SMCC | 8.3 | 不适用 | 是 | 否 | |
| NHS-吡啶硫酚交联剂 | SPDP | 6.8 | 硫醇 | 否 | 是 |
| Sulfo-LC-SPDP | 15.7 | 硫醇 | 是 | 否 |
羧基 - 胺基
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异双功能交联。Sulfo-SMCC (磺基琥珀酰亚胺 4- (N- 马来酰亚胺甲基) 环己烷 -1- 羧酸盐) 是一种胺对巯基交联剂，含有 NHS 酯和马来酰亚胺反应性基团，位于中等长度环己烷稳定间隔臂的相对两端。异型双功能交联剂能够与两个分子进行顺序反应以控制偶联，而无需聚合。
| 反应基团 | 订购产品 | 间隔臂长（Å） | 可被剪切？ | 是否具有水溶性？ | 膜通透性？ |
|---|---|---|---|---|---|
| NHS ester/ aryl azide | |||||
| Sulfo-SANPAH | 18.2 Long | 否 | 是 | 否 | |
| NHS 酯/ 二氮杂环丙烷 | SDA | 3.9 短 | 否 | 否 | 是 |
| Sulfo-SDA | 3.9 Short | 否 | 是 | 否 | |
| LC-SDA | 12.5 中 | 否 | 否 | 是 | |
| Sulfo-LC-SDA | 12.5 Mid | 否 | 是 | 否 | |
| SDAD | 13.5 Mid | 硫醇 | 否 | 是 | |
| Sulfo-SDAD | 13.5 Mid | 硫醇 | 是 | 否 |
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光反应交联。N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯在 pH 7-9 缓冲液中与伯胺基团 (NH2) 高效反应，释放 NHS 后形成稳定的酰胺键。用长波长紫外光 (330-370 nm) 光活化双吖丙啶可生成反应性碳烯中间体。这种中间体可通过与间隔臂长度相对应的距离处任何氨基酸侧链或肽骨架的添加反应形成共价键。
异双功能试剂盒
提供异型双功能试剂盒以通过反应性马来酰亚胺或 DBCO 标记偶联并纯化蛋白，分别与巯基或叠氮化物反应。
| 反应基团 | 订购产品 | 间隔臂长（Å） | 标记量 | 反应次数 | 标记蛋白可与 |
|---|---|---|---|---|---|
| TFP Ester/DBCO | DBCO 蛋白标记试剂盒 | 17.9 | 0.1–0.5 mg | 5 | 叠氮化物 |
| NHS- 马来酰亚胺 | 马来酰亚胺蛋白标记试剂盒 | 8.3 | 0.1–1 mg | 5 | 巯基 |
| 可控蛋白-蛋白交联试剂盒 | 11.6 2.8 | 0.5-5 mg | 1 | 胺巯基 |
* 未确定
胺-胺
巯基 - 巯基
| 巯基 - 巯基交联剂 | 订购产品 | 间隔臂长（Å） | 可被剪切？ | 是否具有水溶性？ | 膜通透性？ |
|---|---|---|---|---|---|
| NHS- 马来酰亚胺 | SMCC | 8.3 | 不适用 | 否 | 是 |
| Sulfo-SMCC | 8.3 | 不适用 | 是 | 否 | |
| NHS-吡啶硫酚交联剂 | SPDP | 6.8 | 硫醇 | 否 | 是 |
| LC-SPDP | 15.7 | 硫醇 | 否 | 是 |
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同双功能交联。DSG是胺与胺交联剂，含有 NHS 酯反应性基团，位于短间隔臂的相对两端。同型双功能交联剂能够与两种分子同时进行反应。
胺-巯基
| 反应基团 | 订购产品 | 间隔臂长（Å） | 可被剪切？ | 是否具有水溶性？ | 膜通透性？ |
|---|---|---|---|---|---|
| NHS- 马来酰亚胺 | |||||
| SMCC | 8.3 | 不适用 | 否 | 是 | |
| Sulfo-SMCC | 8.3 | 不适用 | 是 | 否 | |
| NHS-吡啶硫酚交联剂 | SPDP | 6.8 | 硫醇 | 否 | 是 |
| Sulfo-LC-SPDP | 15.7 | 硫醇 | 是 | 否 |
羧基 - 胺基
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异双功能交联。Sulfo-SMCC (磺基琥珀酰亚胺 4- (N- 马来酰亚胺甲基) 环己烷 -1- 羧酸盐) 是一种胺对巯基交联剂，含有 NHS 酯和马来酰亚胺反应性基团，位于中等长度环己烷稳定间隔臂的相对两端。异型双功能交联剂能够与两个分子进行顺序反应以控制偶联，而无需聚合。
| 反应基团 | 订购产品 | 间隔臂长（Å） | 可被剪切？ | 是否具有水溶性？ | 膜通透性？ |
|---|---|---|---|---|---|
| NHS ester/ aryl azide | |||||
| Sulfo-SANPAH | 18.2 Long | 否 | 是 | 否 | |
| NHS 酯/ 二氮杂环丙烷 | SDA | 3.9 短 | 否 | 否 | 是 |
| Sulfo-SDA | 3.9 Short | 否 | 是 | 否 | |
| LC-SDA | 12.5 中 | 否 | 否 | 是 | |
| Sulfo-LC-SDA | 12.5 Mid | 否 | 是 | 否 | |
| SDAD | 13.5 Mid | 硫醇 | 否 | 是 | |
| Sulfo-SDAD | 13.5 Mid | 硫醇 | 是 | 否 |
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光反应交联。N- 羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 酯在 pH 7-9 缓冲液中与伯胺基团 (NH2) 高效反应，释放 NHS 后形成稳定的酰胺键。用长波长紫外光 (330-370 nm) 光活化双吖丙啶可生成反应性碳烯中间体。这种中间体可通过与间隔臂长度相对应的距离处任何氨基酸侧链或肽骨架的添加反应形成共价键。
异双功能试剂盒
提供异型双功能试剂盒以通过反应性马来酰亚胺或 DBCO 标记偶联并纯化蛋白，分别与巯基或叠氮化物反应。
| 反应基团 | 订购产品 | 间隔臂长（Å） | 标记量 | 反应次数 | 标记蛋白可与 |
|---|---|---|---|---|---|
| TFP Ester/DBCO | DBCO 蛋白标记试剂盒 | 17.9 | 0.1–0.5 mg | 5 | 叠氮化物 |
| NHS- 马来酰亚胺 | 马来酰亚胺蛋白标记试剂盒 | 8.3 | 0.1–1 mg | 5 | 巯基 |
| 可控蛋白-蛋白交联试剂盒 | 11.6 2.8 | 0.5-5 mg | 1 | 胺巯基 |
* 未确定
免称量包装交联剂
蛋白交联 No-Weigh 包装形式提供快速和便利的即用型溶液。这种形式无需称量少量干化合物，避免了浪费未使用材料。只需简单重新溶解，试剂即可按照所需浓度使用。
优质级交联试剂
蛋白交联优质级试剂是配制用于产品完整性和风险最小化至关重要的应用的高质量试剂。这些优级试剂适用于需要一致性能的长期研究项目。交联剂优级产品提供质量保证审查，批次样品保留，变更控制通知，以及更高水平的分析检测和化学表征。
优质级试剂和标准级试剂之间的规格比较
| 检测参数 | 检测方法 | 优质级 | 标准等级 |
|---|---|---|---|
| 纯度 | 使用内参进行定量 NMR | 是 | 是 |
| 目视 | 颜色评估 | 是 | 是 |
| 溶解度 | 样品在去离子水中溶解为指定浓度的溶液，以产生透明无色溶液 | 是 | 是 |
| 识别 | 红外光谱技术 | 是 | 是 |
| Mass identity | 质谱分析 | 是 | 不适用 |
| 含水量 | 卡尔费休滴定法 | 是 | 不适用 |
| 痕量金属 | 电感耦合等离子体质谱分析 (ICP-MS) | 是 | 不适用 |
| 元素分析 | 燃烧分析 (报告的值包括 C ， H ， N ， O 和 S) | 是 | 不适用 |
| 残留溶剂分析 | 顶空气相色谱分析 | 根据要求 | 不适用 |
体内蛋白交联
体内 交联可用于表征蛋白相互作用和配体 - 受体相互作用，而不考虑处理条件。各种大小的 体内 交联剂可用于靶向表面和细胞内蛋白，以通过免疫沉淀 (IP) ， Co-IP ，染色质免疫沉淀 (ChIP) ，电泳迁移率变动实验 (EMSA) ， Western 印迹，免疫荧光 (IF) 和免疫组织化学 (IHC) 等不同方法进行分析。
同型双功能，胺反应性， NHS 酯交联剂
NHS 酯 交联剂广泛用于体内交联。NHS 酯的胺特异性反应快速高效，因为大多数蛋白表面的赖氨酸残基丰度高且易于获取。同型双功能交联剂使用 " 鸟枪法 " 型方法鉴定蛋白复合物，因为其交联了赖氨酸残基在交联剂间隔长度内的所有相互作用分子。后续检测只需要靶向复合物中的一个分子的特异性抗体或探针。
几种体内交联方法的对比在淬灭前，用 PBS 中的 1％ 甲醛（HCHO）或 1 mM 同型双功能 NHS-酯交联剂（Thermo Scientific DSG and DSS）处理 HeLa 细胞 10 分钟。根据步骤，对第四组 HeLa 细胞进行处理并与 4 mM Photo-亮氨酸、2 mM Photo-蛋氨酸（Photo-AA）交联 10 分钟。分别用 100 mM 甘氨酸 pH 3 和 500mM Tris pH 8.0 对经甲醛处理的细胞和经 NHS-酯处理的细胞进行淬灭，用时 15 分钟。然后将每种实验条件下的106细胞裂解，并将 10 μg 的每个样品在 65°C 下含 50 mM DTT 的还原缓冲液中加热 10 分钟，然后使用 SDS-PAGE 和 Stat3 特异性抗体进行Western blot分析（细胞信号传导）。使用 GAPDH（Santa Cruz）和 β-actin（US Biologicals）作为内参进行Western Blot分析。
异型双功能，光反应性， NHS 酯 / 双吖丙啶交联剂
NHS 酯 / 双吖丙啶交联剂将 NHS 酯化学与基于双吖丙啶的光化学相结合以产生交联。虽然典型的异型双功能交联剂需要正确距离的特定氨基酸基团，但 SDA 交联剂通过使用 NHS- 酯然后紫外光交联一种蛋白来利用一种 " 两步法 " 反应，以通过双吖丙啶部分激活交联到第二种蛋白上的任何氨基酸。
- 细胞表面蛋白分离
- Sulfo-SDA， 3.9 Å 垫片
- Sulfo-LC-SDA， 12.5 μ m Å 间隔
- Sulfo-SDAD， 13.5 Å 间隔，可裂解
- 细胞内蛋白质交联
使用 NHS 酯双吖丙啶交联剂实现 EEA1 蛋白复合物的细胞内交联。 在 PBS 中使用 1 mM SDA ， Sulfo-SDA 或 SDAD 标记 HeLa 细胞 (2 x 10^6) 10 分钟。未反应的 NHS- 酯经 Tris • HCl ， pH 值 8.0 用 100 mM 的最终浓度淬灭 5 分钟，然后用 PBS 冲洗。通过使用 365 nm 波长的 2400 nm 的流线型连接器，将标记的细胞和模拟处理的对照 (-) 进行紫外辐照，并在 PBS 中的 4 cm 处持续 15 分钟。紫外处理后，使用 Thermo ScientificM-PER 哺乳动物蛋白提取试剂裂解细胞，并使用 Thermo Scientific Pierce BCA 蛋白检测试剂分析总蛋白浓度。将 µg 缓冲液加入到每份样品中，但含有重复的 SDAD 处理样品 (DTT) ，通过 SDS-PAGE 分离。通过 Western 印迹法使用抗 EEA1 和 GAPDH 抗体分析结果。
光反应性氨基酸交联剂
代谢标记中使用的光 - 亮氨酸和光反应 - 蛋氨酸通过蛋白合成 (3) 掺入蛋白中。这些无毒光胺酸是非侵入性的，不会改变细胞的代谢。光 - 亮氨酸和光反应 - 蛋氨酸具有高度特异性，是研究疏水相互作用的理想选择。此外，它们可用于细胞外或细胞内交联。
使用光反应性氨基酸作为交联剂进行体内标记和交联的方案总结。
光反应性氨基酸和甲醛交联是蛋白质相互作用分析的互补技术。用 1% 甲醛处理 10 分钟 (泳道 2) 或用 光蛋氨酸和光亮氨酸处理 HeLa 细胞， 然后用 UV 处理 (泳道 3)。裂解细胞， 10µg SDS-PAGE 和 Western 印迹分析各 μ g 的细胞，均表达抗 HSP90 ， STAT3 ， Ku70 和 Ku86 的抗体。下部面板为 β - 肌动蛋白 (上部条带) 和 GAPDH (下部条带) ，可作为加载控件印迹。
- Nowak ， D.E. ， Tian ， B. and Brasier, A.R. (2005 年 )。Two-step cross-linking method for identification of NF-kB gene network by chromatin Immunoprecipitation.BioTechniques 39:715-725.PMID: 16315372
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科学文章
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