Search Thermo Fisher Scientific
片段分析 PCR
片段分析：设置 PCR 反应
大多数 GeneScan® 片段分析实验的成功与否取决于 PCR 扩增步骤是否成功。
PCR 组分1：引物对
一个 PCR 引物对由两个寡核苷酸组成，通常长度为15-30个核苷酸，与 DNA 模板互补链杂交并位于感兴趣区域的侧翼。其中一条引物用荧光染料标记，这样一来，在基因分析仪上进行毛细管电泳 (CE) 时，便可检测到 PCR 产物。采用这种双参数方法（荧光标签和片段大小），您可通过单次毛细管进样分析多个独立位点。为在单次 CE 运行中最大限度采集数据，可使用显色不同的染料组合，并可以采用相同的虚拟滤光片集进行检测（见下表）。
| 当 DNA 片段采用以下标记时： | 选择带有以下标记的大小标准品： | 推荐的大小标准品 | 可能的应用 | 其他试剂盒及产品 | ||
|---|---|---|---|---|---|---|
| dR110、dR6G、dTAMRA™、dROX（DS-02 染料集 - 滤光片 E5） | LIZ® |
| ||||
| 5-FAM™、HEX™、NED™（DS-30 染料集 - 滤光片 D） | ROX™ | GeneScan™ 500 ROX™ 大小标准品 | 定制片段分析 | 定制标记引物 | ||
| 6-FAM™、VIC®、NED™（DS-31 染料集 - 滤光片 D**） | ROX™ | GeneScan™ 500 ROX™ 大小标准品 | 定制片段分析 | 定制标记引物 | ||
| 5-FAM™、JOE、NED™（DS-32 染料集 - 滤光片 F） | ROX™ | GeneScan™ 500 ROX™ 大小标准品 |
| |||
| 6-FAM™、VIC®、NED™、PET®（DS-33 染料集 - 滤光片 G5） | LIZ® | GeneScan™ 600 LIZ 大小标准品 v2.0 |
|
Plus A Artifact
“plus A”峰是 PCR 扩增的一个假象，起因为添加了未模板化的 A 核苷酸。Plus A 假象增加了峰图的复杂性，使得识别真正的等位基因峰变得更加困难。反应条件可大幅影响这一位置依赖性假象。当复制 DNA 链的聚合酶将一个额外的碱基 (plus A) 添加到序列的末尾时，就会发生 plus A 假象。添加的 plus A 百分比 (0-100%) 取决于 PCR 产物最后7个碱基。分析结果时，必须保证 plus A 峰高于等位基因峰。当等位基因峰和等位基因 plus A 峰的高度基本相等时（图1），等位基因检出就会产生不确定结果，大约5-10%的标记物会发生这种情况。
通过消除与未模板化核苷酸添加相关的问题，定制加尾引物对所采用的专利反向引物加尾化学法可提高等位基因检出效率。引物加尾方法之所以有效，是因为它控制了聚合酶与双链 DNA 末端结合处的上下序列，添加了未模板化的核苷酸。加尾反向引物包含一个7碱基序列，其以接近100%的比例产生 plus A 产物。
图1. 点击图片放大
图1.反向引物加尾化学法可改善等位基因检出结果。(A) 图示为两份具有相同基因分型的单个样品，采用未加尾引物分析其相同的二核苷酸重复序列标记物。由于影子合并和 plus A 假象，二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复序列可能会形成复杂的峰图。在此示例中，影子峰为峰214和峰212，plus A 假象为峰217、峰215和峰213。峰216是两个样品的正确等位基因峰。尽管两个样品的产物都显示出峰图，但是 GeneMapper® 软件可能仍无法正确检出等位基因，因为等位基因峰 (216) 是产物1的最高峰，而等位基因 plus A 峰 (217) 是产物2的最高峰。这种类型的数据需要手动编辑，以避免在未使用反向引物加尾化学法时出现等位基因检出结果丢失或错误的情况。(B) 在此示例中，峰106是未加尾产物中的等位基因峰。峰114是加尾产物中的等位基因 plus A 峰，该产物包含7碱基尾部和额外的碱基A，因此多了8个碱基。由于 GeneMapper® 软件可自动筛除影子峰，因此消除了 plus A 假象问题，可轻松地检出等位基因。
PCR 组分3：MgCl2
MgCl2（AmpliTaq 聚合酶的辅助因子，为保证良好的酶活性，其必不可缺）。MgCl2 与 dNTP 螯合，因此，随着 dNTP 浓度的增加，MgCl2 的浓度也需增加。
PCR 组分4：缓冲液
该优化的缓冲液随酶一起提供。
进行 PCR 反应
PCR 反应由三个主要步骤组成。反应通常进行30个循环。
- 变性——温度应适合所选择的聚合酶（通常为95°C）。如果模板 GC 含量高，则可增加变性时间。
- 退火——根据计算出的引物解链温度 (Tm) 使用适当的温度（比引物解链温度低5°C）。
- 延伸——在70-72°C 时，DNA 聚合酶的活性最佳，引物以每秒多达100个碱基的速度延伸。
多通路检测策略
采用这种双参数方法（荧光标签和片段大小），您可通过单次毛细管进样分析多个独立位点，并可极大地提高仪器的通量。两种通用多通路检测策略包括：
- 通过将多个引物对组合到同一个 PCR 反应管中，在 PCR 反应过程中实现多通路检测。这一策略可显著降低单次分析成本，不过还需要进行优化。多通路检测引物决不能产生长度相近的产物，且不能使用相同的荧光染料进行标记。引物不能包含大片的互补区域。引物的解链温度应相近。使用这一策略执行 PCR 前，请对引物兼容性进行初步检查并测试引物对能否成功实现共扩增。
- PCR 反应后混合 PCR 产物。这更简单、更灵活，但混合多个 PCR 反应后的产物通常会增加进样样品中的盐浓度，从而带来不必要的下游效应。
备注：用于片段分析的 PCR 产品无需进行纯化即可在基因分析仪上直接进行分离。