利用 NGS 进行病毒监测

Collibri NGS 文库制备试剂盒（用于 Illumina 系统）通过快速建库方案和更高质量的测序序列增强了基于 NGS 的病毒监测。

  • 提高测序序列质量，实现对流行病的可靠追踪
  • 将 Illumina NGS 接头直接加到 mRNA 上，提高 mRNA 测序的准确性和速度
  • 鉴定基因表达差异，有助于理解为什么有些人感染后会病情严重，而另一些人却没有表现出症状

病毒监测

了解疾病传播途径需要政府和个人组织的通力合作。政府主导的项目，如由世界卫生组织 (WHO) 主导的 Global Influenza Programme (GIP) [1]，建立了标准并提供相关培训。

公私联盟，如与美国疾病控制中心 (CDC) 合作的科研实验室，共同对 SARS-CoV-2 (COVID-19) 等流行病进行病毒监测，以采集和分析世界各地的病毒样本。这使得科学界能够监测全球和当地的病毒传播趋势，同时有助于疫苗生产菌株的筛选。病毒传播效率数据也可以为政府在交通、健康筛查和检疫执法政策方面的决策提供信息。

非政府组织（如 Nextstrain.org ）通过整理公共数据库和预测病毒传播趋势来协助病毒监测。NGS 监测可以揭示复杂的传播模式，在这种模式下，非 NGS 监测手段无法检测到病原体。通过对 2020 年 3 月中旬前在华盛顿州采集的 346 份 SARS-CoV-2 病毒样本以及从西雅图流感研究所中获得的样本进行测序，Hodcroft 和来自美国、瑞士的同事估计，该病毒在 2020 年 1 月和 2 月期间在华盛顿州传播，但是未被发现 [2]。

Nextstrain 将病毒传播途径可视化

图 1.传播途径预测。Nextstrain.org的开源病原体基因组项目将公开的 SARS-CoV-2 基因组数据可视化 [3]。

提高病原体序列的质量

虽然通过 NGS 获得的可用全基因组数量快速增长，但这些数据在序列质量方面一直面临挑战。需要使用高质量的序列来追踪流行病，监测人群中潜在的新发病毒，开发可能有效的抗病毒疗法，确定用于疫苗开发的靶标，以及了解宿主-病原体的相互作用。

提高序列质量的一个解决方案是使用文库制备试剂盒，此类试剂盒经设计可用于不同质量和不同基因组大小样本的建库，实现均一的全基因组覆盖。与转座法建库相比，Invitrogen Collibri DNA Library Prep Kits for Illumina Systems 可实现对病原体和宿主基因组的全覆盖。Collibri DNA 建库试剂盒适用于所有大小的基因组，可用于对病原体和宿主进行测序，从而进行宿主-病原体研究。

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Collibri DNA 文库制备试剂盒覆盖整个基因组

图 2.获得全基因组覆盖，以便对整个病毒基因组进行测序。Collibri DNA 文库制备试剂盒的建库流程时间为 1.5* 个小时，可将整个基因组转化为适用于 Illumina 平台的即用型测序文库。其它文库制备方法，如依赖于转座子复合体在整个基因组中随机插入的转座法，不能覆盖片段末端。
*如需进行 PCR ，建库时间多一个小时。

Optimized protocol to sequence SARS-CoV-2 samples

The optimized workflow to sequence SARS-CoV-2 reduces time and sequencing costs while providing flexibility to use available reagents. Generate high-quality genomic coverage from nasopharyngeal, oropharyngeal, and other diverse samples to improve accuracy in SARS-CoV-2 research studies.

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提高 RNA 测序的准确性和速度，用于病原体研究

为了提高 RNA 病毒和其它样本 RNA 测序结果的准确性，Invitrogen Collibri Stranded RNA Library Prep Kits for Illumina Systems 使用了一种独特的建库方案，将辅助接头直接添加到 RNA 上。在建库流程的最后几步，辅助接头通过 PCR 变成适用于 Illumina NGS 系统的全长接头。一般建库试剂盒在添加接头前会将 RNA 转化为 cDNA。与其它建库试剂盒不同，Collibri 文库制备试剂盒由于 cDNA 合成不受 GC 含量影响，所以可保留 RNA 转录物的复杂度。此外，将辅助接头与 RNA 直接连接可提高了 NGS 测序结果的准确性，由于随机寡核苷酸序列没有整合到 cDNA 中，所以可排除错误的 SNP 和点突变。

Collibri 链特异性 RNA 建库方案建库快速（ 4.5 个小时），可获得高度链特异性文库，从而可实现对重叠基因的检测。该建库方案适用于所有大小基因组的 RNA 测序，因此适用于研究病毒基因组、宿主基因表达以及宿主-病原体相互作用。

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图 3.通过将辅助接头直接连接到 RNA 上，此快速建库方案（4.5 小时）可增强测序结果的准确性。 部分接头，也称为辅助接头，在 cDNA 合成前直接连接到单链 RNA 上。通过 PCR 获得全长 indexed adaptor。

解释为什么同样病原体会产生不同结果

NGS 3′ mRNA 基因表达分析是一种强有力的、无假设的研究方法，可以用来研究为什么人们会对同一个病原体有不同的反应，这种方法已被用于研究寨卡病毒感染的影响。 

可以将重症患者的基因表达谱与感染相同病毒但是无症状患者（病毒携带者）的基因表达谱进行比较。3′ mRNA 测序是一种利用简化信息学快速比较多个样本基因表达谱的技术。该方法通过将每个样本的 NGS 测序 reads 从 30–60 M 减少到 2–5 M，流程简化且节约了测序成本。所需测序 reads 的减少同时也有助于灵活选择 Illumina NGS 系统和测序地点。

可以在样本来源附近使用如 Genialis, Inc.公司的分析软件对使用Invitrogen 3′ mRNA Library Prep Kits for Illumina Systems 获取的数据进行基因表达谱分析。

申请试用

A

B

图 4.急性寨卡病毒感染的基因表达谱。使用 Collibri 3ʹ mRNA Library Prep Kit for Illumina Systems，杜兰大学的 Nicholas Maness 博士揭示了急性寨卡病毒感染期间的基因表达模式 (A) 和抑制的白细胞动员 (B)。观看结果解释。

NGS 病毒监测工具（适用于 Illumina NGS 系统）

 DNA
Collibri DNA 文库制备试剂盒		RNA
Collibri 链特异性 RNA 文库制备试剂盒**		RNA
Collibri 3ʹ mRNA 文库制备试剂盒
NGS 测序方法全基因组测序mRNA 测序3ʹ mRNA 测序
病毒研究方向
  • 新病原体的从头组装 
  • 基因组突变 
  • 传播途径 
  • 研究宿主对感染的易感性并预测干扰素反应
  • 检测编码 RNA
  • 基因表达研究 
  • 基因融合 
  • 转录异构体
  • 基因表达
是否适用用于降解的 RNA是（反转录后）*是是
建库时间1.5 小时***4.5 小时4.5 小时
是否兼容所有 Illumina NGS 系统是是是

为了在测序前准确定量测序文库，我们建议使用 Collibri Library Quantification Kit 或 Qubit assays。
*  建议采用 SuperScript IV 逆转录酶进行逆转录
**建议在文库制备前，使用Dynabeads mRNA DIRECT Purification Kit 进行 mRNA 富集。
***如包含 PCR，建库总时间多一小时

参考文献

  1. Global Influenza Programme
  2. Bedford T, et al.Cryptic transmission of SARS-CoV-2 in Washington State. medRxiv 2020.04.02.20051417; doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.02.20051417.
  3. Hadfield J, Megill C, Bell SM, Huddleston J, Potter B, Callender C, Sagulenko P, Bedford T, Neher RA.Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution.Bioinformatics.2018 Dec 1;34(23):4121-4123.

相关资源

手册

案例分享和采访

DNA 测序

所有测序方法

RNA 测序

仅供科研使用，不可用于诊断目的。