测序反应

循环测序是一种简单的方法，在热循环仪中连续进行几轮变性、退火和延伸，引起延伸产物线性扩增。然后将这些产物进样到毛细管中。所有现有的 Applied Biosystems DNA 测序试剂盒均使用循环测序方案。我们重点关注两种常用的测序化学方法：Dye Primer 化学法和 Dye Terminator 化学法。

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选择适合您应用的 BigDye® 化学试剂

赛默飞持续开发卓越的 Sanger 测序试剂盒，为您的所有应用和模板提供解决方案。下表提供了指南，可帮助您在三种主要测序试剂盒之间进行选择。

测序特异性BigDye®
Direct ‡		BigDye®
Terminator V3.1		BigDye®
Terminator V1.1
所有类型的测序xxxxxx
高分辨率地读取靠近测序引物的数据xx–xx （使用 POP-6™ 时）
M13 加尾 PCR 引物和 M13 测序引物*xx ‡xx
通用加尾引物，非 M13 引物–xx
长读长 (>650 bp)xxxx
混合碱基（杂合子），比例为 10/50 到 50/50xxxxx
高 GC 含量，高 GT 含量，具挑战性的模板†xxx

x   满意
xx  出色
–   不建议

†  BigDye® Direct、BigDye® Terminator V3.1 和 BigDye® Terminator V1.1 将为这些模板的大多数提供良好的序列质量。在一些情况下，dGTP BigDye® 终止子专为这些具挑战性的模板而设计，可以提供较好的结果

‡  BigDye® Direct 需要使用 M13 加尾引物进行 PCR 反应。该试剂盒包含 BigDye® Direct PCR 预混液、 BigDye® Direct 测序预混液（可在一步反应种进行 PCR 纯化和测序反应）、BigDye® Direct M13 正向引物 (5′ TGTAAAACGACGGCCAGT 3′) 、BigDye® Direct M13 反向引物 (5′ CAGGAAACAGCTATGACC 3′) 和对照 DNA CEPH 1347-02。

*为什么采用 M13 加尾 PCR 引物或其他通用加尾引物？
测序工作流程采用 M13 或通用引物可简化工作流程并减少人为错误的可能性。

有关更多信息，请访问第二个选项卡，Sanger DNA 测序 网页上测序引物。

测序应用和特定要求

PCR 产物测序（重测序）。
重测序的定义为对 DNA 分子进行测序，然后与已知或参比序列进行比较。重测序或靶向测序用于发现通常与表型变化相关的序列变异，以确定不断演化的变化和/或生物学鉴定。重测序可能专注于与疾病相关的基因的编码区，或者其可能靶向全基因组，以发现 SNP 以及个体间的其他序列变异。比较测序通常定义为对不同物种或亚种的特定区域进行测序，以鉴定高度保守的区域。重测序通常是通过 PCR 扩增基因组特定区域，然后从两个方向对 PCR 片段进行测序，以生成高质量的 DNA 序列。有关重测序不同策略的信息，请参阅测序化学指南。

PCR 产物测序的测序试剂盒标准：先读取引物后第一个碱基，混合碱基检测。使用 M13 引物可作为一个极好的解决方案来简化工作流程。

有关 M13 引物的更多信息，请访问第二个选项卡，Sanger DNA 测序 网页上测序引物。

NGS 序列验证
Sanger 测序是验证新一代测序结果的金标准。这通常是通过对经下一代测序鉴定的感兴趣区域对应的 PCR 产物进行 Sanger 测序来完成的。

甲基化测序
CpG 残基的甲基化可以通过用亚硫酸氢钠处理基因组 DNA 来确定，亚硫酸氢钠将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不受亚硫酸氢盐转化的影响。将亚硫酸氢盐转化 DNA 序列与未处理 DNA 的序列比较，结果明显表明存在甲基化 C 残基，因为其在亚硫酸氢盐转化 DNA 中显示为 C。非甲基化 C 被转化为 U （测序反应中被转化为 T ），因此显示为 T。原则上，根据可用信息和研究目标，有两种甲基化方法：甲基化特异性 PCR 或亚硫酸氢盐特异性 PCR 。研究者进行亚硫酸氢盐处理，以将表观遗传事件转化为体外可检测的永久基因变化，因为原始甲基化在 PCR 过程中会丢失。
将亚硫酸氢钠处理过的 DNA 序列与未经处理的基因组 DNA 序列进行比较，可以精确鉴定 DNA 长段内的所有甲基化胞嘧啶。有两种方法可用于收集甲基化测序数据。这两种方法均需要亚硫酸氢盐转化和 PCR 扩增，但是在一种方法中，PCR 片段直接进行测序，而在另一种方法中，先克隆片段，然后对克隆进行测序。有关甲基化测序方法，请参阅测序化学指南。

甲基化测序的测序试剂盒标准：混合碱基检测。

仅供科研使用，不可用于诊断目的。