PSC 资源手册 - 重编程

通过强制表达特定转录因子将细胞重编程为多能状态，从而将体细胞转化为 iPSC。迄今为止，研究人员已经对不同的重编程因子以及具有不同效率和安全性水平的多种类型基因递送技术进行了测试（图1.1）。

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图 1.1.各种重编程技术的安全性和效率。不同的重编程试剂可被归类为整合、可切除或非整合技术，并且安全性也随前述顺序依次增加。在每个类别下，各种技术按效率依次降低的顺序列出

使用慢病毒或逆转录病毒的传统转录重编程技术涉及将外源 DNA 整合到宿主基因组中。这可能导致插入诱变，进而可能影响衍生细胞系的特性。在细胞重编程领域目前的总体趋势是非整合技术，因为其可以避免插入突变的问题并产生不含可检测载体或转入基因的无印迹 PSC。

两种常见的非整合重编程技术是分别利用游离型载体和仙台病毒 (SeV)。本节将更详细地讨论这两种技术。其他非整合重编程技术则是利用 mRNA、miRNA、蛋白质、以及其他小分子。

不同的细胞重编程技术有其自身的优点和缺点，在设计实验时必须进行权衡。需要考虑的主要问题包括实验室在处理病毒方面的灵活性、预期的亲本体细胞、下游实验所需的效率、以及避免任何基因组整合可能的重要性。Invitrogen Epi5 iPSC 游离重编程试剂盒 和 Gibco CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试剂盒的特点在表 1.1 中进行了比较。通常，CytoTune 重编程试剂盒非常适用于难以转录重编程的亲代细胞以及需要更高效率重编程和无痕迹 iPSC 的实验。Epi5 重编程载体适用于易于转录重编程的亲代细胞，特别是当不能使用病毒颗粒时。
 

游离型载体是染色体外的环形 DNA 分子，其可用于引入和表达外源遗传物质。由于这类载体携带病毒元件，允许重编程因子的延长和受控表达，但却不需要病毒包装进行细胞转染，因此它们是十分具有吸引力的重编程载体。 

一种目前流行的游离型载体系统特异性地整合了来自 Epstein-Barr 病毒的 oriP/EBNA1 系统。oriP 序列是一个顺式作用元件，其作为重编程载体的 pCEP 主链上的复制起点；EBNA1 能够编码与 oriP 结合的 DNA 结合蛋白，并在复制过程中将质粒与基因组 DNA 连接，从而确保每个循环仅允许一次复制。同时，oriP 和 EBNA1 元件可确保在每次细胞分裂期间重编程载体的复制和保留，从而驱动重编程基因的高表达并允许单次转染后的 iPSC 衍生 [1]。每个细胞周期游离型载体的丢失速率约为 5%，因此 iPSC 可自行去除载体而无需任何额外的操作 [2]。因此，虽然重编程载体能够保留足够长的时间以便重编程发生，但它们会随着时间流逝而丢失，从而新衍生出不含转染 DNA 和整合的转入基因的无印迹 iPSC。

研究已经证明敲低 p53 可以提高重编程的效率 [3,4]，与传统的短发夹 RNA (shRNA) 系统相比，mp53DD 显性阴性突变体能够提供更高效率的敲低 [5]。Okita 等人描述了一种改进的重编程系统 [6]，其包含携带重编程因子和 mp53DD 的游离型载体。在该系统中，额外的 EBNA1 表达载体能够确保在重编程的早期阶段重编程因子的高表达。

Epi5 Episomal iPSC 重编程试剂盒包含基于上述研究的一组完整的载体（图 1.2）。该试剂盒包括两个管：重编程载体管，含有编码 Oct3/4、Sox2、Klf4、L-Myc 和 Lin28 的三种质粒的混合物；第二个管含有编码 p53 显性阴性突变体和 EBNA1 的两种质粒的混合物。

图 1.2. Epi5 重编程试剂盒中的载体
 

将所有这些载体组合在一起，Epi5 重编程系统可实现约 0.01 至 0.1% 的效率，并可用于重编程不同的细胞类型，包括 CD34+ 血细胞。要启动重编程，试剂盒还必须与基因递送系统结合使用（图 1.3）。

Invitrogen Neon 转染系统 可以让载体以电穿孔的形式转染到大多数细胞类型中。对于成纤维细胞来说，可以通过使用 InvitrogenLipofectamine 3000 转染试剂实现有效的重编程而无需电穿孔。

图 1.3.仙台病毒和游离型载体重编程工作流程的比较（从各种体细胞类型开始）。

SeV 是一种包膜病毒，具有负义单链 RNA 基因组。该基因组可编码用于形成并支持包膜的结构蛋白（NP 和 M）、RNA 聚合酶亚基（P 和 L）、识别唾液酸的血凝素-神经氨酸酶 (HN)、以及在感染期间当被蛋白酶激活时将病毒包膜与细胞膜进行融合的融合蛋白 (F)。

有两个主要特征使 SeV 成为极具吸引力的重编程系统。首先，由于 SeV 通过附着在许多不同细胞表面上存在的唾液酸来感染细胞，因而它可以感染来自各种动物物种的多种细胞类型。其次，SeV 载体由 RNA 构成并保留在细胞质中，从而可确保它们不会整合到宿主基因组中或改变宿主细胞的遗传信息 [7-9]。这一点与逆转录病毒载体相反，逆转录病毒载体需要整合到宿主染色体中以表达重编程基因，它甚至也与腺病毒和质粒载体不同，这些载体是以游离形式存在并且不需要进行整合，但是由于这些载体都是基于 DNA 的，因而仍具有整合到宿主染色体中的可能性。

通过删除 F 基因进行修饰并在 SeV 蛋白中引入温度敏感性突变（SeV/TSΔF 和 SeV/TS15ΔF）对 SeV 进行修饰，就可以安全有效地递送和表达重编程基因 [7-10]。这些修饰阻止了基因传递并减少了重编程载体的传播。因此，包含在细胞质中的病毒载体最终会被稀释掉，从而留下无印迹的 iPSC。

目前，有两种基于 Fusaki 等人开发的 SeV 系统的 CytoTune 重编程试剂盒 [7]。其中，CytoTune-iPS 2.0 仙台病毒重编程试剂盒仅包含三个载体，第一个包含 Oct4、Sox2 和 Klf4；第二个含有 c-Myc；第三个含有额外的 Klf4 以实现更高的重编程效率（图 1.4）。CTS CytoTune-iPS 2.1 仙台病毒重编程试剂盒也包含三种载体：和 2.0 试剂盒中一样的 KOS 和 Klf4，以及第三种携带 L-Myc 的载体，据报道它比 c-Myc 的致癌风险更低（表 1.2）。CytoTune 试剂盒中提供的仙台病毒载体可有效重编程成纤维细胞、PBMC、CD34+ 细胞、以及 T 细胞（工作流程如图 1.3 所示）。

图 1.4.CytoTune 2.0 重编程试剂盒中的载体构成
 

虽然许多研究人员选择用真皮成纤维细胞开始重编程实验（图 1.5），但 CytoTune 试剂盒已被证明可在多种体细胞类型中进行有效的重编程，其中包括 PBMC、CD34+ 细胞、以及 T 细胞（图 1.6）。

区分“好”集落和“坏”集落的两种主要方法包括形态学和活细胞染色 （图 1.7）。随着克隆的建立，残留的仙台病毒会从细胞群中清除。通常，10 次传代即可完全清除仙台病毒载体（图 1.8）。

生成稳定的 iPSC 细胞系后，在进行分化之前证明细胞系的质量和实用性至关重要。诸如免疫荧光、qPCR 和流式细胞分析等检测方法对于验证该细胞系是否具有产生所有三个胚层细胞的能力是非常有用的（图 1.9 和 1.10）。同时，传统的细胞遗传学分析对于证明正常的核型也十分重要（图 1.9）。

1. Yu J, Hu K, Smuga-Otto K, et al (2009).Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences.Science 324(5928):797–801. 
2. Nanbo A, Sugden A, Sugden B (2007).The coupling of synthesis and partitioning of EBV’s plasmid replicon is revealed in live cells.EMBOJ 26(19):4252–4262. 
3. Hong H, Takahashi K, Ichisaka T, et al (2009).Suppression of induced pluripotent stem cell generation by the p53-p21 pathway.Nature 460(7259):1132–1135. 
4. Spike BT, Wahl GM (2011). p53, stem cells, and reprogramming: tumor suppression beyond guarding the genome.Genes Cancer 2(4):404–419.
5. Kawamura T, Suzuki J, Wang YV, et al (2009).Linking the p53 tumour suppressor pathway to somatic cell reprogramming.Nature 460(7259):1140–1144.
6. Okita K, Yamakawa T, Matsumura Y, et al (2013).An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.Stem Cells 31(3):458–466. 
7. Fusaki N, Ban H, Nishiyama A, et al (2009).Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome.Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci 85(8):348–362.
8. Li HO, Zhu YF, Asakawa M, et al (2000).A cytoplasmic RNA vector derived from non-transmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.J Virol 74(14):6564–6569.
9. Seki T, Yuasa S, Oda M, et al (2010).Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells.Stem Cell 7(1):11–14.
10. Inoue M, Tokusumi Y, Ban H, et al (2003).Non-transmissible virus-like particle formation by F-deficient Sendai virus is temperature sensitive and reduced by mutations in M and HN proteins.J Virol 77(5):3238–3246.