PSC 资源手册 - 分化

iPSC 制备通常是达到真正实验目标的中间步骤。在这种情况下，使用 PSC 的目的是利用 iPSC 的增殖能力和多能性来产生几乎无限数量的成熟的分化细胞类型，包括神经元、心肌细胞、β （胰岛）细胞，或者在人体中可以想见的任何其他细胞类型（图 5.1）。这些 PSC 来源的细胞可用于多种应用，例如：

• 模拟人类胚胎发育
• 难分离的细胞来源应用于基因研究和疾病建模中
• 药物筛选应用
• 细胞替代疗法

图 5.1.通过 EB 中间体将 PSC 分化为不同谱系

最近，不同谱系的分化方案已变得越来越明确。大多数方案都绕过了 EB 形成这一步，从而有效地创造了一个黑盒子，使得在其中控制分化的信号转导事件我们很难知晓。

相反，近些年研发的方案倾向于贴壁培养，在此过程中细胞会暴露于暂时明确的小分子组合中。使用有效的小分子来取代生长因子仍可以实现分化，这不仅更具成本效益，而且更有效。

随着实验方案变得更加明确，对分化至特定细胞类型所需的信号转导机制也变得越来越复杂。目前，对于分化实验方案进行评估的重点通常更多地围绕所生成细胞的有效性和功能性。但是 iPSC 来源细胞类型能在多大程度上准确还原体外和体内原代细胞的行为呢？这些细胞类型又是否能够表达与该细胞谱系相关的标志物呢？其又是否在功能测定中能有预期的表现呢？同时在许多情况下，最重要的一点是，当移植到动物模型后其是否能够整合并在体内表现出正常的功能呢？

最后一个考虑因素是有关 iPSC 来源细胞的成熟度。通过 PSC 分化得到的细胞我们其默认表现出胎儿或新生儿表型。这可以通过胎儿相关标志物的表达来证实，例如 iPSC 来源红细胞中的胎儿球蛋白或 iPSC 来源肝细胞中的甲胎蛋白。相反，在 iPSC 来源细胞中成年标志物的表达应该是较低或不存在的，例如 iPSC 来源肝细胞中细胞色素 P450 的水平。 

这可能是药物筛选和细胞治疗应用或研究迟发性疾病（如阿尔茨海默病或帕金森病等神经退行性疾病）的研究人员所关注的问题，因为疾病特异性表型可能不会在胎儿时期的细胞中表现出来。

该领域目前的研究正在探索让 iPSC 衍生细胞类型在体外老化和成熟的方法，并且可以预期在不久的将来将发现更多解决该问题的方法。但在此之前，建议您牢记这一点，并将其纳入下游研究的影响在内加以考虑。

在开发分化实验方案过程中、尝试应用文献中发表的实验方案或选择市售分化试剂盒时应考虑如下一些关键因素：

• 高品质的细胞——最终细胞群是否表达与体内的该细胞类型相关的标志物？其是否在体外和体内的功能测定中表现如预期？
• 明确的实验方案——实验方案是否使用成分明确的培养基和底物，或者其是否包含血清或 BSA 等成分？其是否涉及 EB 形成步骤或是否需要与基质细胞系共培养？这些因素可能将变异性引入分化实验方案中，并使标准化和优化变得更加困难。
• 速度——获得所需的细胞群需要多长时间？
• 效率——所需细胞群的产量有多高？是否同时产生了大量非预期的“污染”细胞类型？
• 可重复性——在不同批次实验和不同用户所得的细胞和其制备效率是否一致？
• 稳健性——实验方案是否能够高效且一致地应用于多个 ESC 和 iPSC 细胞系？一些实验方案是根据少数几种细胞系开发的，因而要将其应用于其他细胞系可能需要进行大量优化工作。
• 成本——该实验方案是否需要大量昂贵的重组生长因子或专门的组织培养板？
• 用户友好——需要多少种不同的培养基？细胞必须每过多久传代一次或其是否需要其他操作？该实验方案是否需要费力的挑取步骤，例如神经花环结构细胞（神经前体样细胞）的挑取？
• 可扩展性——实验方案是否可以扩大规模以生产大量细胞？培养基的成本是否令人望而却步？利用培养板形式或需要手动操作的培养系统是否不适合更大规模的培养？
• 可保存性——细胞是否能作为成熟细胞冷冻、或是在中间阶段进行冷冻以建立细胞库，还是每次都必须制备新鲜细胞？
• GMP 兼容性——如果有意开发潜在临床应用，研究人员可能会在意该方案使用的是否是 GMP 试剂，如果不是，那么该方案今后是否能够轻易转换为 GMP 兼容的实验方案。如果一开始就使用遵循 GMP 制造的试剂或使用其中的 RUO 试剂能够轻松用 GMP 试剂替代的实验方案，则可以节省大量的时间、精力和成本。在后期当项目准备好进行临床试验时，研究人员必须按这些标准来修改和优化实验方案。 

查看完整的分化产品组合，请访问 thermofisher.com/differentiation

神经细胞的分化可以通过神经干细胞 (NSC) 中间体由 PSC 获得，这些衍生的细胞不仅包括神经元，还包括胶质细胞，如星形胶质细胞和少突胶质细胞（图 5.2）。NSC 是一种增殖性细胞群体，其可以很容易地扩增和存储以供进一步使用。NSC 具有多能性，并且具有产生不同神经元亚型和神经胶质细胞的能力，这取决于它们暴露于何种谱系特异性成熟条件。iPSC 来源 NSC 的可保存性和多能性使其成为许多应用所关注的方法，包括疾病建模、药物发现以及细胞疗法。

NSC 分化或诱导的早期方案依赖于 EB 中间体、基质共培养、和/或玫瑰花环结构的形成（需要在扩增前手动分离）。这些实验方案定义不明确、效率低且劳动强度大。最近，研究人员已经开发出依赖于在限定条件下分化的贴壁培养物的方案，其能够快速且高效地诱导 NSC 群体。

图 5.2.通过 NSC 中间体从 PSC 产生神经细胞类型。PSC 的神经特性使得其可以产生可扩增的 NSC 群体，通过暴露于不同谱系特异性信号转导因子而进一步分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。在 NSC 阶段的细胞也可以容易地通过冷冻来保存，使得这一细胞群体非常适于大量细胞储存。支持这些不同细胞群和转变的培养基系统亦显示在图中。
 

神经诱导

PSC 神经诱导培养基是一种无血清培养基，仅在 7 天内即可对 hPSC 进行高效的神经诱导（图 5.3）。与其他方法不同，使用 PSC 神经诱导培养基不需要 EB 形成的中间步骤，从而避免了增加时间、劳动力和可变性。

使用 PSC 神经诱导培养基生成的高质量 NSC 具有高表达的 NSC 标志物，并且可以进行冷冻保存、扩增，并进一步分化成其他神经细胞类型（图 5.4）。

有关更多信息，请访问 thermofisher.com/nscdiff

成熟

为了进一步使 NSC 成熟为特定的下游谱系（如少突胶质细胞、星形胶质细胞或神经元亚型），必须将 NSC 暴露于其谱系特异性的成熟因子中。因此，这些条件必须针对每种细胞类型进行确定和优化。不同专向分化谱系的关键信号转导通路总结见图 5.5。

图 5.5.调节 NSC 向特定神经细胞和神经元亚型分化的关键信号转导通路总结。
 

来源于人类多能干细胞 (hPSC) 的神经干细胞分化而来的神经元使科学家能够从前所未有的大量多样化患者群体中对人类神经疾病进行研究。然而，在分化时和分化之后，神经细胞培养物通常会被增殖的神经前体细胞污染，这些神经前体细胞会形成团块并使得研究人员几乎不可能对成熟神经元进行关键的下游测定。 

Gibco CultureOne 补充剂可以添加至任何常规的神经元分化培养基中，以消除超过 75% 的污染神经前体细胞，同时保证最少的细胞死亡，并且对激酶介导的信号通路没有影响。由此获得的均匀分布的分化神经元优质培养物能够改善下游分析、加速神经元成熟、并能将培养物维持 5 周或更长时间 （图 5.6 和 5.7）。
 

图 5.6.添加 CultureOne 补充剂可实现优质的神经细胞培养。在常规 NSC 分化中，培养物将会过度生长，并且含有前体细胞 (Sox1) 和分化神经元 (MAP2) 的混合群体。前体细胞的过度生长将导致团块形成，随着维持时间的延长，其会导致细胞从培养板上剥离。添加 CultureOne 补充剂可消除 NSC 分化中的前体细胞，从而获得由分化的神经元组成的优质培养物。这些培养物不会发生过度生长或细胞团块生成，可以非常容易地维持 5 周或更长时间。
 

B-27 Plus 神经元培养体系

引用最多的神经细胞培养系统由 Gibco B-27 补充剂 和Neurobasal神经基础培养基组成。该体系最初是为大鼠海马和皮质神经元的长期培养而优化的，经过二十多年的研究，这个组合已被证明适用于广泛的其他神经应用，其中包括 PSC 来源 NSC 和神经元。

但随着科学家对于更可靠、更具生物学相关性模型建立的需求越来越强烈，越来越需要诞生新一代的培养基体系，使其能够满足在体外长期维持和成熟处于最佳培养密度的功能神经元的需求。Gibco B-27 Plus 神经元培养体系采用更优化的配方、升级的生产工艺，以及更严格的原材料和终产品质控手段。这些改进使神经元存活率增加了 50% 以上，并能够加速神经突起生长、改善电生理活动和神经元成熟 （图 5.8 和 5.9）。

图 5.8.B-27 Plus神经元培养系统能够提高人类干细胞衍生神经元的存活率。冷冻保存的 HIP 神经元 (MTI-GlobalStem) 在包含 B-27 补充剂的经典 Gibco 神经基础培养基中解冻，并以两倍所用培养基的体积，接种于聚乙烯亚胺包被的 96 孔板上。将神经元维持 4 周，每周进行两次半量换液。用神经元树突标志物 MAP2（绿色）和神经胞体标志物 HuC/D（红色）对神经元进行免疫染色，并用 DAPI 对细胞核进行复染 （蓝色）(A)。对比研究表明 B-27 Plus 神经元培养系统与经典的添加 B-27 补充剂的神经基础培养基相比，是一种更加优越的培养基，其在长期培养中能够改善神经元的存活和健康水平 (B)。
 

图 5.9.B-27 Plus 神经元培养系统可增强和加速神经元成熟。(A) 体外培养第 22 天的大鼠皮质神经元用树突标志物 MAP2 进行染色 （红色），突触前终端用 synapsin 1/2 进行标记（绿色），DAPI 作为复染剂 （蓝色）。(B)在 B-27 Plus神经元培养系统中维持的神经元的突触素阳性信号点的数量明显更多。(C) 冷冻保存的小鼠皮质神经元在经典的添加有 B-27 补充剂的神经基础培养基中解冻，并接种于聚-D-赖氨酸包被的 96 孔板上。根据供应商所推荐的实验步骤，将神经元在 B-27/Neurobasal 或 B-27 Plus/Neurobasal Plus培养基系统中维持约 3 周。在指定时间点，利用 IncuCyte™ 分析系统 (Essen BioScience) 拍摄的差分干涉对比图像对神经突起生长进行定量。与含有 B-27 添加剂的经典神经元基础培养基相比，B-27 Plus 神经元培养系统在前几周可显著加速神经突起生长。
 

多巴胺能神经元的分化

源自 hPSC 的中脑多巴胺能 (DA) 神经元为用于疾病建模和药物筛选的原代人神经元提供了可行的替代方案。虽然 NSC 可分化出可表达 DA 标志物的神经元群体，但研究表明底板中间体这一阶段对于生成具有功能性、中脑特异的 DA 神经元来说是必不可少的（Kriks 等（2011）; Kirkeby 等(2012)）。

Gibco PSC 多巴胺能神经元分化试剂盒能够将多能干细胞 (PSC) 分化为分泌多巴胺并表现出自发动作电位的中脑多巴胺能神经元。与将 PSC 分化为多巴胺能神经元（可能具有生物学限制性、冗长且不明确性）的其他实验方案或市售解决方案不同，我们的试剂盒可提高实验的灵活性、速度和可扩展性，同时保持适当的生物学相关性 （图 5.10 和 5.11）。
 

图 5.10.简化的工作流程图。在 Essential 8 培养基中培养的多能干细胞可以分化至中脑底板，并经过扩增和保存，然后在 35 天内成熟为中脑多巴胺能神经元。源自底板的中脑前体细胞可扩增至最多 10 代。
 

图 5.11.成熟 DA 神经元的代表性图像。该图像是在多巴胺能神经元成熟培养基中底板前体细胞成熟 14 天后，使用 Invitrogen 人类多巴胺能神经元免疫细胞化学试剂盒中所提供的试剂对细胞进行染色获得的。大多数表达 TH 的神经元也共表达 FoxA2。在这些图像中使用的细胞染料包括抗 TH（绿色）(A) 、抗 FoxA2（红色）以及 Invitrogen NucBlue 染料（DAPI 核 DNA 染料）（蓝色）(B)。(C) 合并图像。
 

神经元功能和细胞健康检测

iPSC 是疾病建模的强大工具。它们使研究人员从患者特异性 iPSC 建立的疾病相关细胞类型对疾病特异性表型进行研究成为可能。通过基因编辑可以更容易地产生等位基因对照，这一点还使得研究人员可以消除供体变异的影响，并且可以识别细微的疾病特异性表型并提高相关数据的可信度。然而，这需要能够用于检测相关表型的检测方法。

神经元是一种复杂的细胞类型，有许多种对其适用的细胞类型特异性检测。最典型的例子是，iPSC 来源神经元的电生理活性可以通过膜片钳或使用多电极阵列进行测定，从而确定神经元亚型特异性动作电位活动或评估神经毒性化合物的影响。

NSC 可用于针对多种细胞应激原的高通量检测 （表 5.1），以评估神经细胞的健康状况（图 5.12）。如果用神经元和神经胶质细胞共培养物，用于鉴别细胞自主调控疾病与非自主调控疾病的表型，或确定神经胶质细胞的神经保护作用，则这些检测的复杂性会更高。 

表 5.1.可用于测定神经细胞健康不同方面的精选检测方法。
 

图 5.12.用一组功能检测，通过 NSC 对各种细胞应激原应答过程以检测细胞的健康水平。 iPSC 细胞系分别来自一个患帕金森病 (PD) 的供体 (PD-3)、一个患多系统萎缩 (MSA) 的供体、以及两个年龄匹配的健康对照个体（Ctrl-1 和 Ctrl-2）；并使用 PSC 神经诱导培养基分化成 NSC 细胞群。分化的 NSC 在 Gibco CTS CELLstart 基质上的神经扩增培养基中进行七次传代，然后在 Gibco StemPro NSC SFM 中进行另外四次传代。收集 NSC 并接种至 CTS CELLstart 基质包被的 384 孔检测板中，从而通过四个高通量测定进行评估。使用 Tecan Safire 酶标仪 (Tecan Group Ltd.) 对荧光进行测定。代表性的结果显示为 (A) 使用 nvitrogen PrestoBlue 检测试剂盒对 Ctrl-2 检测结果表明随着添加的应激原浓度的增加，代谢活动与预期一样有所下降，(B) 使用 Invitrogen CellEvent Caspase-3/7 Green 检测试剂盒 对 MSA 的检测结果表明随着添加的应激原浓度的增加，细胞凋亡与预期一样有所增加， (C, D) 使用多重 Invitrogen CellROX Green 检测试剂盒和 MitoSOX Red 检测试剂盒对 PD-3 的检测结果表明随着添加的应激原浓度的增加，氧化应激与预期一样有所增加。

很少有功能行为能像 iPSC 来源心肌细胞的自发节律性收缩那样让人印象深刻。

由于动物模型研究很大程度上受限于人和啮齿动物心脏电生理特性的显著差异，因此人 iPSC 来源心肌细胞仍然是研究遗传性心肌病十分重要的系统。然而，应该注意到的是 iPSC 来源心肌细胞会表现出胎儿时期的表型。

iPSC 来源心肌细胞的应用包括疾病建模、细胞替代疗法（例如在心肌梗塞后）、以及越来越多地在药物开发期间进行心脏毒性筛选。 

PSC 心肌细胞分化试剂盒

Gibco PSC 心肌细胞分化试剂盒由一组无血清和无异源培养基组成，能够在短短 8 天内有效地将 hPSC 分化为收缩的心肌细胞。与需要多种成分和更长检测持续时间的其他方法不同，PSC 心肌细胞分化试剂盒能以即用型培养基形式在较短的时间内将 PSC 分化成心肌细胞。

该试剂盒包含三种不需要解冻或混合的 1X 培养基，每种培养基连续使用 14 天，从而产生功能性心肌细胞，这些细胞能够表达相关的生理标志物，可在培养中收缩，并且可在培养中保持 15 天以上。

通过优化条件，可以从一系列 ESC 和 iPSC 细胞系高产量制备可表达 TNNT2 的心肌细胞 （图 5.13）。对于可能更难分化的 iPSC 细胞系，我们的基于代谢选择的补充富集实验方案可以将产量提高 10-30%。

您可以通过以下链接找到我们的标准试剂盒方案以及富集方案 thermofisher.com/cardiacdiff

图 5.13.多个 PSC 细胞系的有效分化。接种密度对于最佳的 PSC 心肌细胞分化来说至关重要。在这些研究中，使用经 Gibco TrypLE 试剂解离的 PSC 进行实验。在通过 CyoTune 重编程来源的两个细胞系中，观察到 BS2 iPSC 在较高密度下开始变得混杂。研究人员也发现 Gibco 人类游离态 iPSC 细胞系 (GEPI) 在特定密度下表现最佳。而 H9 hESC 在各种密度下都出现结果混杂。JMP Profiler 工具可确定最佳的接种密度，从而有效的进行不同 PSC 细胞系的分化。
 

心肌细胞维持培养基 

GIBCO 心肌细胞维持培养基是一种无血清和无异源的培养基，能够维持经 PSC 心肌细胞分化试剂盒分化得到的心肌细胞。该培养基包含在试剂盒中，但也可以单独出售，以满足想要长时间在培养物中维持分化的心肌细胞的需求。 

人心肌细胞免疫细胞化学试剂盒

Invitrogen 人心肌细胞免疫细胞化学试剂盒能够实现两个关键心肌细胞标志物的最佳图像分析：NKX2.5 和 TNNT2/cTnT （图 5.14）。它是唯一一种能为心肌细胞提供优质成像试剂的试剂盒，其包含一整套一级和二级抗体、核 DNA 染色剂以及所有预制缓冲液，可进行优化的染色实验。

心肌细胞功能检测

iPSC 来源心肌细胞的表型和电生理特征与其相应的原代细胞类似。自发形成的搏动细胞特别适合用于表征和分析。收缩过程同时伴随有细胞内钙水平的振荡，钙水平可以使用钙敏感染料进行测定，同时也可以量化细胞对心脏毒性化合物的反应（图 5.15 和 5.16）。通过基因组编辑引入疾病相关的 SNP（见第 4 节）后，还可以将该系统用于疾病建模 （图 5.17）。

图 5.15.用于对 hiPSC 来源心肌细胞进行功能测定的高通量检测方法，该方法是通过使用 PSC 心肌细胞分化试剂盒生成的心肌细胞开发的。分化后，将心肌细胞重新接种于 96 孔或 384 孔板中，并加入 Invitrogen fluo-4 染料或 FluoVolt 探针以分别测定钙通量或电活性。然后可以记录、分析信号瞬变并将其转换为有意义的数据。该测定可用于心脏安全性筛选或疾病模型筛选。
 

图 5.16.使用高通量功能测定可用于研究未知化合物对心肌细胞的影响。图中显示了经 β-肾上腺素能刺激剂异丙肾上腺素 (ISO) 或钙通道阻滞剂维拉帕米 (VRP) 处理后的心肌细胞中 fluo-4 的变化轨迹。然后，可根据这些迹线数据来产生收缩心肌细胞的不同特征的剂量-效应曲线，例如图中的搏动率。
 

定形内胚层包含中间细胞群，其能够产生下游谱系，包括胰腺、肝脏和肠道。与许多其他谱系一样，制备功能相关的成熟细胞类型的分化方案最好能够复现胚胎发育期间的逐步分化，其中包括定形内胚层中间体这一阶段。

下游谱系可用于多种疾病的建模和细胞疗法，包括糖尿病中的胰岛 β 细胞和肝细胞的代谢紊乱。iPSC 衍生的肝细胞还具有在药物发现过程中用于肝毒性研究的潜在用途。

由于需要激活素蛋白和 Wnt 信号转导，传统用于定形内胚层诱导的方案可能十分昂贵。 

PSC 定形内胚层诱导试剂盒 Gibco

PSC 定形内胚层诱导试剂盒由两种无异源培养基组成，其能够有效诱导 hPSC 分化为定形内胚层（图5.18）。与需要多种组分并需要 5 天或更长时间的其他诱导方法不同，PSC 定形内胚层诱导试剂盒 只需两种组分在 2 天内即可生成 ≥90% 的 CXCR4+/PDGFRα- 定形内胚层细胞（图5.19）。

每种培养基都以 1X 完整配方的形式提供，不需要混合其他组分，PSC 细胞系分化所得的定形内胚层都显示出关键标志物 Sox17 和 FoxA2 的高表达 (>90%)（图5.20），并且能够分化为下游谱系（图5.21）。

欲了解更多，请访问：thermofisher.com/defendo

图 5.18.PSC 定形内胚层诱导试剂盒可以以非常高的效率 (≥90%) 在多种 hESC 和 iPSC 细胞系（包括使用游离态载体或 Invitrogen CytoTune 试剂盒重编程的细胞系）中产生定形内胚层细胞群。代表性点阵图显示了衍生自各种细胞系的 CXCR4+/PDGFRα- 细胞群。在每个实验中，未染色的细胞用于设置象限门。 
 

PSC 定形内胚层诱导试剂盒

图 5.19.与其他分化方案相比，PSC 定形内胚层诱导试剂盒产生目的细胞的时间缩短了 50%，并且不需要预分化或混合培养基。。 
 

图 5.20.PSC 定形内胚层诱导试剂盒处理的 hESC 的免疫细胞化学分析。在第 3 天，对诱导细胞的中内胚层转录因子 Sox17 和 FoxA2 以及多能标志物 Oct4 进行免疫染色。细胞核用 DAPI 进行复染（蓝色）以评估细胞总数。
 

图 5.21.定形内胚层可分化为下游谱系。使用 PSC 定形内胚层诱导试剂盒对 H1 ESC 进行处理，使其分化为能够表达相关生理标志物的功能细胞：(A) 中肠/后肠（核，蓝色；FoxA2，绿色；Cdx2，红色）；(B) 胰腺内胚层（核，蓝色；FoxA2，绿色；Pdx1，红色）；(C) 肝芽祖细胞（核，蓝色；AFP，红色）。数据来源于新加坡基因组研究所的 LT Ang、KM Loh 以及 B Lim。