PSC 资源手册 - 基因组编辑

从广义上讲，基因工程或基因组编辑包括通过破坏、替换或添加序列来改变生物体的 DNA。虽然小鼠胚胎干细胞 (ESC) 的基因操纵已在制备转基因小鼠模型应用中广泛使用数十年，但近期基因组编辑技术的发展使得这一工具现在能够非常容易地应用于 hPSC。

hPSC 自我更新和分化的能力使其非常适合以药物开发和细胞治疗所需规模制备疾病模型和细胞。目前对 hPSC 进行遗传修饰的能力进一步增加了这些细胞在研究和临床应用方面的实用性，可用于生成复杂遗传疾病的模型。

iPSC 和基因组编辑方法的结合可支持多种应用（图 4.1），包括：

• 通过在对照 iPSC 中引入已知突变来产生疾病模型 
• 通过校正患者特异性 iPSC 中的突变来产生近等基因对照 
• 通过选择性地敲低或敲除野生型 iPSC 中的基因座来检测所涉及基因的疾病相关性
• 通过选择性校正个别基因座，在多基因疾病中辨析多基因座的影响
• 产生谱系特异性报告细胞系
• 在细胞替代疗法中，用于生成经过基因校正的疾病相关细胞类型 

欲了解有关我们的基因组编辑产品和服务的更多信息，请访问 thermofisher.com/genomeedit

图 4.1.使用基因组编辑产生疾病特异性和近等基因对照（野生型，WT）iPSC，以及疾病相关细胞类型。从健康或患者供体中分离体细胞（如成纤维细胞或血细胞）(A)，并进行重编程以产生对照和疾病特异性 iPSC (B)。基因组编辑可用于将疾病相关突变引入对照 iPSC 以产生疾病特异性 iPSC。也可通过基因校正从疾病特异性 iPSC 产生近等基因对照 (C)。在功能测定中，疾病表型可能能够通过比较疾病相关细胞类型（例如衍生自对照和患者特异性 iPSC 的神经元或心肌细胞）的行为来进行定量 (D)。 
 

成功的基因组编辑项目设计受到几种选择的影响，首先便是基因组编辑工具的选择。同时，需要考虑的其他因素还包括递送方法、细胞培养系统、以及编辑验证技术（图 4.2）。赛默飞世尔科技可为您提供一套优化的工具，以帮助您实现高水平的成功率。这些内容将在以下部分中更详细地进行阐述。 

基因组编辑曾经是一个费力且低效的过程，使用随机诱变或较老的技术（如锌指核酸酶）难以设计和靶向基因组中的特定位点。目前，基因工程工具的最新进展可以在用户友好的工作流程中实现卓越的精确度和可控性。

现在，通过使用 CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）和转录激活因子样 (TAL) 效应子技术，人们可以常规地实现基因组编辑。CRISPR gRNA 和 TAL 效应子将核酸酶靶向基因组中的特定位点，从而在所需位置产生双链断裂（图 4.3）。

细胞的天然修复机制可通过同源重组或非同源末端连接 (NHEJ) 的方式来修复断裂区域。其中，同源重组更为精确，因为它需要模板进行修复。通过向细胞提供含有靶序列的合成模板，例如疾病特异性突变，研究人员可以将该序列引入基因组中。相比之下，NHEJ 的双链断裂修复更容易出错，经常会引入诸如小插入或缺失（插入缺失）之类的错误。由此产生的移码通常会导致无功能基因的形成，因此研究人员可利用这种方法快速有效地产生特定的基因敲除。

最初，与 TAL 技术相比，Invitrogen CRISPR 基因组编辑技术被认为更有效，但也更容易产生脱靶效应。但随着用于两种基因编辑系统的工具和试剂发展，二者间的差异已经可以忽略了，并且 CRISPR 和 TAL 技术目前均已广泛用于大量应用中。这两种技术的优点和局限性见表 4.1 中的总结。

图 4.3.可用的基因组编辑技术。
 

易于设计和构建

TAL 靶标识别通过 TAL 效应蛋白和 DNA 靶序列之间的蛋白质-DNA 相互作用来实现。因此，如果需要编辑新位点，则需要设计和构建特定于该序列的新蛋白质。尽管可用模块的重复组合大大简化了 TAL 效应蛋白克隆的过程，但这对于用户来说仍然是一个重要的痛点。另一方面，CRISPR 基因编辑则依赖于 RNA-DNA 复合物形成。如果需要靶向新位点，仅需设计和生成 20 nt gRNA 即可为系统提供特异性。这可以非常轻松经济地实现，因而通常对学术研究人员来说极具吸引力。

靶位点选择

TAL 的靶向性意味着 TAL 对可设计成几乎可靶向基因组中的任意位置，但 CRISPR 的功能性要求 gRNA 靶序列紧接在三碱基 PAM 序列（通常是 NGG）之前。在设计敲除实验时，靶向的确切基因区域具有更大的灵活性，因而找到 PAM 序列通常不是问题。然而由于编辑效率将取决于与 PAM 位点的距离，该序列可能会严重限制使用供体 DNA 进行同源重组时的位点可用性。因此，在设计可行的敲入实验时，TAL 效应子可能是更好的工具。

特异性

过去业内一直认为 TAL 具有较少的脱靶效应，这是由于该系统的 DNA 结合位点较长，因而降低了其与基因组其他区域同源的可能性。在潜在的细胞治疗应用中（例如在使用 CAR T 细胞时），TAL 基因编辑固有的高度特异性显得尤其重要。相比之下，CRISPR 工具对 gRNA 和预期 DNA 靶标之间的错配具有相对高的耐受性，这可能对特异性产生负面影响。然而，与基于 DNA 或 RNA 的系统不同，目前较新的工具，例如 Invitrogen TrueCut Cas9 蛋白 v2，在引入细胞中后具有更短的半衰期和更快速的效果，可以大大降低脱靶效应。

效率

使用 CRISPR 可实现的高切割效率可能是许多研发应用中的决定性因素。该特征还使得 CRISPR 可作为基于 RNAi 的筛选的替代方法，其适用于使用基于慢病毒的 CRISPR 文库的高通量应用，更使其适于同时靶向多个位点。使用 TAL 对进行编辑的效率可能会受到系统对 CpG 甲基化敏感性的影响。因此如果使用 TAL 靶向高甲基化水平的区域，一些 TAL 对可能失效。

递送

TAL 和 CRISPR 均可通过脂质转染和电穿孔的方式引入。

许可

值得注意的是，对于希望将其基因编辑产品进行商业应用的研究人员，TAL 技术为此提供了明确的许可途径。与 CRISPR 编辑相关的知识产权情况目前尚不够明朗。可能还需要一段时间才能获得有关 CRISPR 工具用于适当商业用途的明确指南。有关许可的更多信息，请通过 outlicensing@thermofisher.com 联系我们。

基因组编辑使用工程化核酸酶结合内源性修复机制，改变细胞中的 DNA。CRISPR-Cas9 系统利用短 gRNA 将细菌 Cas9 核酸内切酶靶向特定的基因组位点。由于 gRNA 可提供特异性，因此改变靶位点仅需在设计时改变编码 gRNA 的序列。

CRISPR-Cas9 系统由 DNA 核酸内切酶 Cas9 和非编码短导向 RNA (gRNA) 组成，其中 gRNA 拥有两个分子组件：一条靶标特异性 CRISPR RNA (crRNA) 和一条辅助的反式激活 crRNA (tracrRNA)。gRNA 通过将 crRNA 序列与基因组位点中的靶向序列进行碱基互补配对，从而引导 Cas9 蛋白来到特异性的基因组位点（图 4.4）。

CRISPRCas9 系统拥有高度灵活且特异的靶向能力，通过改造其可被重新定义为基因组编辑的有力工具。CRISPR-Cas9 技术能够对多种细胞进行靶向基因切割和基因编辑，并且由于 CRISPR-Cas9 系统中内切酶消化的特异性是由 RNA 序列来引导的，因此实际上只需控制 gRNA 的序列，并将其与 Cas 核酸内切酶一同导入靶细胞，该系统即可在几乎任何基因组位点实现基因编辑操作。

CRISPR-Cas9 递送形式

不同形式的 CRISPR 工具可用于特定的研究需求，这些形式包括：CRISPR-Cas9 一体化表达质粒、CRISPR-Cas9 mRNA 和 gRNA、Cas9 蛋白、Cas9 iPSC、以及 CRISPR 文库（图 4.5）。使用 CRISPR 质粒载体和 mRNA，可非常轻松地编辑 PSC；然而，使用 TrueCut Cas9 蛋白 v2 在 HPSC 中观察到了最高的切割效率。

图 4.5.可用的 CRISPR-Cas9 递送形式。
 

表4.2.Invitrogen CRISPR 技术对比。
 

TrueCut Cas9 蛋白 V2

新开发的 TrueCut Cas9 蛋白 v2 是一种野生型 Cas9 蛋白，旨在为一系列靶基因和细胞类型提供始终如一的更高编辑效率。

• 在所有测试的细胞系中（包括标准、免疫、原代、以及干细胞），其都表现出很高的编辑效率
• 与其他供应商的试剂盒相比，其对于难度较高的靶基因的编辑效率提高了 2 倍 
• 高品质 - 严格按照 ISO 13485 质量标准生产 
• 经验证的实验操作 - 使用针对广泛细胞类型进行优化的实验操作，帮助您更快地获得成功结果

CRISPR gRNA

使用 CRISPR-Cas9 系统进行基因编辑时，高质量 gRNA 的设计、生产和递送对于获得成功结果至关重要。我们以多种形式供应 CRISPR gRNA，其中包括可直接用于转染的 gRNA 和慢病毒递送系统。使用下面的选择指南为您的实验找到合适的 gRNA（表 4.3）。

TrueGuide 合成 gRNA

TrueGuide 合成 gRNA 是可直接用于转染的合成 gRNA，其经验证能够与 Invitrogen 基因组编辑工具套件一起使用，提供一致的高效编辑。无论您需要经济的常规编辑任务解决方案，还是希望提高编辑效率（特别是在原代或干细胞中），TrueGuide 合成 gRNA 均能为您提供在细胞系中引入特定编辑所需的试剂（图 4.6）。

图 4.6.与 TrueCut Cas9 结合使用时，TrueGuide gRNA 与 IVT gRNA 性能相当。图中显示了针对两个靶点的插入/缺失诱导效率，以及其中一个靶点的 SNP 诱导效率 (%HDR)。tg：两段式 TrueGuide gRNA，sg：一段式 TrueGuide gRNA；IVT：IVT gRNA。
 

CRISPR 基因编辑工作流程

一旦选择了特定的 CRISPR 形式，便可通过脂质介导的转染或电穿孔将其引入靶细胞。以低密度接种细胞以允许克隆集落的扩增。然后细胞经过选择并筛选用于基因编辑。图 4.7 展示了一个示例工作流程。 

图 4.7.使用 CRISPR-Cas9 技术的标准基因编辑工作流程。在 StemFlex 培养基系统中进行 hPSC 扩增后，将细胞单一化并用 Neon 系统进行电穿孔，从而将预复合的 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和 TrueGuide 合成 gRNA 对照导入细胞中。在 Geltrex 底物 或 rhLaminin-521 上，将细胞在含/不含 RevitaCell 补充剂的 StemFlex 培养基中进行复苏。复苏 48-72 小时后，使用 GeneArt 基因组切割检测试剂盒评估切割效率。成功切割后，回收细胞并在克隆扩增前传代 2 代。此时，基于 Tra-1-60 的阳性表达和 PI 的阴性表达，对存活的 PSC 进行流式分选。随后将细胞以 1 细胞/孔的密度接种在含 StemFlex 培养基的 rhLaminin-521 包被 96 孔板中。复苏 14 天后，确定克隆扩增成功，然后通过测序确认克隆生成的细胞系中基因编辑成功。
 

虽然 293T 等主要细胞系的基因编辑已变得非常常规，但成功编辑 PSC 仍然需要进行大量优化。除了优化 Cas9 和 gRNA 递送之外，PSC 电穿孔后的恢复和随后的克隆扩增也十分具有挑战性。以下我们将概述相关最佳操作范例，以最大限度提高您的成功概率。

1. 培养——虽然基因编辑所需的 PSC 维持似乎是一个常规步骤，但让您的细胞转换至一种在基因编辑工作流程瓶颈期仍能支持 PSC 存活的培养基尤其重要。StemFlex 培养基专为这些具有挑战性的应用提供最佳的性能。这是一种无饲养层培养基，无需酶促或机械去除小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 等会降低转染效率的步骤。与其他无饲养层培养系统不同，StemFlex 培养基即使在没有 ROCK 抑制剂的情况下，也能在单一化及 Cas9-gRNA 复合物转染后仍保证稳健的细胞存活。它还可支持单个细胞的克隆扩增，并可兼容隔天补液计划，不仅减少了基因编辑前的工作量，而且也是克隆扩增阶段的关键步骤。 
2. 递送——可通过任意一种脂质转染试剂（例如 Invitrogen Lipofectamine 干细胞转染试剂）实现 Cas9 和靶 gRNA 递送。然而，使用 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和 Invitrogen TrueGuide 合成 gRNA，并利用 Invitrogen Neon 系统通过电穿孔进行 RNP 转染，能获得最高的切割效率（图 4.8 和 4.9）。最佳的 Neon 设置可能因培养条件、所用细胞系以及递送的内容物而异。这些设置甚至可能在 PSC 细胞系之间有所不同。因此，我们建议用户使用优化方案测试所有 24 种电穿孔条件，根据编辑效率和细胞活力，并凭经验确定其特定细胞系的最佳操作步骤（图 4.10）。
3. 复苏——对于许多科学家来说，使用 Cas9 RNP 进行电穿孔后的细胞复苏是 PSC 基因编辑过程中的第一个重要瓶颈。细胞不仅需要经历应激电穿孔过程，而且该实验方案还要求在电穿孔之前将细胞单一化。StemFlex 培养基能够使经过 Cas9 RNP 复合物电穿孔后的细胞实现最佳复苏，从而解决了这一痛点 （图 4.11）。 
4. 分析——在继续克隆扩增之前，建议首先确认靶位点已成功切割。这可以帮助确定实现最佳编辑效率的条件，从而进一步用于细胞系的生成。请参阅第 4.6 节“TAL 和 CRISPR 的筛选方法”以了解更多细节。
5. 克隆扩增——建立成功编辑的克隆 PSC 细胞系无疑是基因编辑工作流程中最具挑战性的一步。细胞可以通过有限稀释进行接种，但是为了减少筛选的孔数，我们建议先将细胞进行流式分选，然后以 1 个细胞/孔的密度将活的多能细胞 (TRA-1-60+, PI–) 接种于 96 孔板中（图 4.12）。StemFlex 培养基是唯一经测试能够在无 ROCK 抑制剂的情况下在上述应激条件下从单个细胞建立克隆系的培养基。通常，使用该培养基可实现 20-50% 的克隆复苏率。
6. 测序——可以通过靶位点处的 Sanger 测序或通过 Ion PGM 测序确认克隆细胞群中目标靶序列的正确编辑，并且可同时确认不存在脱靶效应。有关其他详细信息，请参见第 4.5 节“TAL 和 CRISPR 的筛选方法”。

疾病相关靶标的 CRISPR 基因编辑

在原理验证研究中，将引起疾病的突变引入稳定表达 Cas9 的 hiPSC 细胞系中。通过 Neon 电穿孔对 gRNA 和携带待修饰的 SNP 的单链寡聚供体进行递送，从而引入一些心脏病和帕金森病特异性突变（图 4.13）。在不同基因组位点突变产生的文库中，插入缺失形成和同源驱动修复介导的 SNP 的引入具有各异的编辑效率（图 4.13A）。通过 FACS 对单细胞克隆进行分离产生了针对每种靶标的野生型、插入缺失、杂合、以及纯合编辑的不同分布，并且在每种情况下，无论在编辑后文库中的效率如何都鉴定出了纯合克隆（图 4.13B）。通过 Ion PGM 测序，可以通过计算超过 10,000 个结果中的等位基因比率来定量验证克隆类型。野生型或纯合子编辑将 ~100% 具有某一等位基因，而杂合子将具有 ~50% 的一个等位基因和 ~50% 的另一个等位基因。然后，这些克隆系可以被分化成所需的细胞类型以模拟目标疾病。 

转录激活因子样 (TAL) 效应蛋白是植物致病性细菌蛋白，其能够结合特定 DNA 序列并在植物发病机理中充当转录因子。TAL 的 DNA 结合结构域含有高度保守的 32-34 氨基酸重复序列，其中 12 和 13 位的氨基酸除外。这两个氨基酸，称为重复可变二残基或 RVD，决定了每个重复对靶序列内单个特定核苷酸的特异性。由于其模块化的结构域结构和明确定义的氨基酸-核苷酸编码，因此含有与各种功能结构域缀合的 TAL 的融合蛋白可以非常特异地靶向基因组内的基因座。

诸如 Invitrogen GeneArt PerfectMatch TAL 等产品的基因组编辑过程使用的是与截短的 FokI 核酸酶融合的 TAL 对。FokI 核酸酶以同源二聚体的形式起作用，并在两侧具有 TAL 结合位点的 DNA 上产生双链断裂。当与断裂区域具有同源性的 DNA 不存在时，细胞的天然机制将尝试通过 NHEJ 对断裂进行修复，而这一过程可能导致插入缺失。在蛋白质编码区域，这些插入缺失可导致移码突变，从而导致基因破坏（敲除）。 

当与断裂区域具有同源性的 DNA 存在时，则可以发生同源定向修复，这一过程可将添加 DNA 并入断裂的位点。以这种方式，可以在基因组内用户定义的位置引入特定的碱基或序列（图 4.14）。使用 TAL 对培养后的 iPSC 进行基因编辑的示例工作流程包含以下步骤（图 4.15）：

• TAL 构建体的设计和合成
• 在存在或不存在供体 DNA 的情况下用 TAL 构建体转染和电穿孔 iPSC
• 细胞克隆恢复
• 挑选和筛选集落以确定成功的切割和编辑
• 成功编辑克隆的扩增、表征和保存 

图 4.15.使用 TAL 技术进行 iPSC 基因组编辑的工作流程。在 Geltrex 基质包被的孔板中用 StemFlex 培养基对 iPSC 进行无饲养层培养，培养后的细胞经 RevitaCell 补充剂处理后，使用 StemPro Accutase 细胞解离试剂对细胞进行解离。使用 Neon 转染系统将含有或不含有供体 DNA 的 TAL 构建体电穿孔至解离的细胞中，然后以低密度接种到 Geltrex 或 rhLaminin-521 包被的孔板上进行恢复。1-2 周后，挑选并筛选集落，并根据 GeneArt 基因组切割检测试剂盒、Applied Biosystems TaqMan SNP 基因分型检测试剂盒、或 Ion PGM 测序仪所获得的结果进行选择。将最终选择的克隆进行扩增并表征，以在建立细胞库前确认其多能性和基因组完整性。
 

疾病相关靶点的 TAL 效应子编辑

在最近的概念验证研究中，Invitrogen GeneArt TAL 被用于校正来自帕金森病患者的 iPSC 中的 LRRK2 G2019S 突变。该研究的相关内容综述如下。富含亮氨酸的重复激酶 2 (LRRK2) 是一种大的多结构域蛋白，其含有一个催化核心及其两侧的蛋白-蛋白相互作用结构域，该催化核心包含 GTP 酶和激酶结构域。尽管 LRRK2 基因在帕金森病中的确切作用尚不清楚，但 LRRK2 中的几个突变与该疾病相关，其中 G2019S 是最常见的突变。将 LRRK2 G2019S 突变校正回野生型需要通过同源重组进行编辑，该过程涉及使用位于该区域侧翼的 GeneArt TAL 对，以及包含所需校正序列的 1 kb 供体 DNA，该序列可以将突变体中的 A 改变回野生型 G（图 4.16A）。在 LRRK2 校正的初始筛选中，使用 Invitrogen GeneArt 基因组切割检测试剂盒测定的 140 个集落中有 2 个 (1.4%) 表现出编辑阳性（图 4.16B，集落 26 和 27）。将这两个集落再进行亚克隆并使用 TaqMan SNP 基因分型检测试剂盒进行重新筛选 （图 4.16C）。然后，对阳性集落进行 Ion PGM 测序以确认细胞群的克隆类型（图 4.16D）。

欲阅读完整的研究，请访问 thermofisher.com/diseasemodels

图 4.16.将 LRRK2 G2019S 校正为野生型的帕金森病供体 iPSC 的产生。(A) 帕金森病细胞系中 LRRK2 G2019S 区域的序列。TAL 对的结合位点已用红色下划线标出。将 TAL 与 1 kb 纯化的 PCR 片段一起电穿孔至细胞中，该 PCR 片段含有野生型序列和 500 bp 侧翼序列。(B) 使用 GeneArt 基因组切割检测试剂盒进行集落筛选。在经筛选的 140 个集落中，集落 26 和 27 几乎没有显示出由于错配而导致的切割产物，表明其杂合突变已大致校正为纯合野生型。(C)TaqMan SNP 基因分型检测试剂盒证实克隆 26 和 27 以及它们的子集落含有纯合野生型等位基因，因为等位基因判别图中，这些克隆（红色）的检测结果与野生型对照（来自野生型供体质粒或来自 HEK 293 细胞的野生型模板）的结果显示在相同的区域中。(D) Ion PGM 测序显示亲本系的杂合状态为 53% G，在初步编辑形式的集落 26 中为 93% G，最终在三个子集落中表现为纯合编辑状态 100% G。 

当使用基因组编辑工具（如 CRISPR 或 TAL 效应子）以获取靶向突变时，建议先确定采用这些核酸酶切割靶序列的效率，再继续进行费力且昂贵的克隆扩增步骤。基因编辑后，可以通过单细胞分选轻松获得单细胞克隆。依靠 StemFlex 培养基、rhLaminin-521 基质、以及 RevitaCell 补充剂，单细胞可以在 96 孔板中沉积和扩增，扩增时长可达 ~2 周。然后，所形成的克隆可以经过合并和扩增，以用于建立细胞库和基因组编辑事件的筛选 （图 4.17）。该方法不需要进行第二轮克隆分离，因此优于低密度接种和手动拣选。

图 4.17.集落筛选工作流程。在对单一化的 hiPSC 进行基因组编辑后，可以通过基于 FACS 的方法获得克隆系。将单个存活的多能干细胞沉积到 96 孔板中，并让其在 rhLaminin-521 基质上的 StemFlex 培养基中生长 10-14 天。此时，可以冷冻保存合并的 96 孔板，并用指定的测定方法对基因组编辑进行筛选。 

多种工具和试剂可用于快速确定哪些细胞已成功编辑，其中包括 TaqMan SNP 基因分型检测试剂盒、Invitrogen GeneArt 基因组切割选择试剂盒、GeneArt 基因组切割检测试剂盒和 Ion PGM 测序。这些技术的比较见表 4.4。

表 4.4.常见基因组分析方法的比较。

使用 GeneArt 基因组切割选择试剂盒进行筛选

GeneArt 基因组切割选择试剂盒是一种快速可靠的工具，其可用于检测转染细胞中工程化核酸酶的功能以及修饰细胞的富集（图 4.18）。当使用工程化的核酸酶在基因组 DNA 中产生双链断裂时，知道所设计的核酸酶是否具有功能是十分必要的。此外，为了有效筛选修饰的细胞，还需要一种能够富集编辑后细胞的方法，特别是在工程化的核酸酶的效率较低或所用的细胞系难以转染时。GeneArt 基因组切割选择试剂盒包含带有橙色荧光蛋白 (OFP) 基因的载体，可快速直观地检查工程化核酸酶的功能。此外，报告基因 OFP 和 CD4 可用于富集编辑后的细胞。该试剂盒可以与基因组编辑工具结合使用，例如 ZFN、TAL 效应核酸酶、以及 CRISPR。

使用 GeneArt 基因组切割检测试剂盒进行筛选

GeneArt 基因组切割检测试剂盒提供了相对快速、简单和可靠的测定，其能够评估基因组编辑工具在给定基因座处的切割效率（图 4.19）。将编辑后的细胞群样品用作直接 PCR 模板，并使用对靶向区域特异的引物。然后，将 PCR 产物变性并再退火以产生异源双链错配，由于其中已发生双链断裂，因而会导致插入缺失。该错配会被检测酶识别并切割。这种切割可通过凝胶分析轻松检测和定量。

了解更多，请访问 thermofisher.com/genedetect

图 4.19.GeneArt 基因组切割检测法为了检测特定 DNA 序列中的插入缺失或突变，首先使用对该区域特异的引物对该区域进行扩增。为了增加灵敏度，可以进行第二次巢式 PCR。在加热样品并使 PCR 产物再退火后，含有插入缺失或序列中有其他变化的扩增子将与未修饰序列的扩增子形成异源双链体。当用仅在错配存在下才能进行切割的核酸内切酶处理这些异源双链体时，会产生两段已知大小的 DNA，其可通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。