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PSC 资源手册 – 转染
本页内容
3.1 简介
3.2 选择一种转染方法与技术
3.3 DNA 转染
3.4 mRNA 转染
3.5 RNP 复合物转染
3.1 简介
干细胞可自我更新并分化成不同特殊细胞类型的能力有希望为未来再生医学的应用以及新型治疗方案的开发带来巨大贡献。对干细胞可进行基因操作的技术为开发新的基因修正以及组织替换治疗的前临床及临床研究提供了支持。在无饲养层培养条件下利用诸如 StemFlex 及 Essential 8 培养基等系统进行后续干细胞分离及扩张的能力进一步推动了干细胞研究从实验室向临床的转化。
在不抑制细胞活性及细胞生长的前提下进行干细胞转染已被证明相当困难，因为递送方法本身必须对干细胞的属性没有或仅有极少的影响（如转染后多能性的维持），进而保证下游检测结果的可靠性。诸如基因编辑、基因表达以及定向分化等研究应用均需要将各种不同构建体递送至干细胞内。使用 CRISPR-Cas9 系统的基因编辑新技术也需要递送大型质粒构建体或者 DNA、RNA 以及 Cas9 核糖核蛋白 (RNP) 复合物的组合。
3.2 选择转染方法和技术
您需要考虑到不同转染方法与技术各自的优缺点。然而，非病毒转染方法是将外源分子递送至细胞内最为常用的方法（图 3.1）。在进行细胞转染时需要考虑的主要因素包括转染效率、毒性、多功能性及成本。基于这些关键因素的考虑，推荐使用以下产品（表 3.1）。
图 3.1.根据细胞类型推荐的转染方法。
表 3.1.干细胞转染选择指南——不同产品的推荐有效载荷以及不同细胞类型的转染效率（更多的方块代表更高的效率）。
3.3 DNA 转染
质粒 DNA 依然是转染中最为常用的转基因构建体。直到最近，也很难在干细胞中通过使用化学转染试剂实现高水平的 DNA 递送。然而，随着近期 Invitrogen Lipofectamine Stem 转染试剂的推出，科研人员可轻松获得 60% 甚至更高的转染效率。
Lipofectamine Stem 转染试剂经优化可高效地将 DNA 递送至干细胞（人 ESC 及 iPSC）中（图 3.2）。该试剂经验证还可在 PSC 中实现大型质粒 (>10 kb) 的高效递送，并同时支持 PSC 在未分化状态的持续增殖（图 3.3）。
诸如基因编辑等应用经常需要编码基因编辑构建体或模板 DNA 的大型质粒，并通常需要采用电穿孔来实现细胞转染。Lipofectamine Stem 试剂可用作电穿孔方法的有效补充，采用一种对细胞更为温和的方式将较宽范围的质粒 DNA 引入干细胞中。Lipofectamine Stem 试剂还可与多种细胞培养基兼容，包括无饲养层培养系统，如含有玻连蛋白的 Essential 8 培养基以及含有 Geltrex 基质的 StemFlex 培养基（图 3.4）。此外，作为电穿孔的一种替代方案，人 PSC 还可在重新接种时采用悬浮转染。
A. 人多能干细胞 (Gibco iPSC)
B. 人胚胎干细胞 (H9 ESC)
图 3.2.利用 Lipofectamine Stem 试剂在人干细胞 (A) iPSC 及 (B) ESC 中实现高效 DNA 转染。
转染大型 DNA 构建体
Lipofectamine Stem 试剂可将大型质粒 (>10 kb) 高效递送至人 PSC 中，并同时支持 PSC 在成分明确且复合的无饲养层培养系统中以未分化状态持续进行增殖。
图 3.3.相对于其他领先供应商试剂具有显著更高的大型 DNA 构建体递送效率。(A) 在 mTeSR1 培养基中采用一种领先的 DNA 递送试剂将 11 kb DNA 质粒转染至 H9 ESC 中。(B) 在 mTeSR1 培养基中采用 Lipofectamine Stem 试剂将 11 kb DNA 质粒转染至 H9 ESC 中。(C) 在 StemFlex 培养基中采用 Lipofectamine Stem 试剂将 11 kb DNA 质粒转染至 H9 ESC 中。
图 3.4.Lipofectamine Stem 试剂可兼容多种培养基系统。结果展示了转染后 38-44 小时的人 PSC。接种于 24 孔板的人 iPSC 采用 1 或 2 µL 的 Lipofectamine Stem 试剂在 (A) 位于 Geltrex 基质上的 StemFlex 培养基、(B) 位于玻连蛋白上的 Essential 8 培养基以及 (C) 位于 Geltrex 基质上的 mTeSR1 培养基中进行转染。
温和处理细胞——让细胞保持活力和健康
由于干细胞较为敏感，对其进行转染且不抑制细胞活性和增殖十分具有挑战性。转染需要在将外源核酸引入细胞与在此过程中不杀死该细胞之间取得平衡。Lipofectamine Stem 试剂可高效地递送微量核酸 图 3.5。Lipofectamine Stem 试剂可在转染过程中维持干细胞的健康与增殖。(A) 人 iPSC 培养于无饲养层的 Essential 8 培养基中，并采用 Lipofectamine Stem 试剂进行转染，附对照组（不转染）。细胞保持正常形态，且健康有活力，并在持续的转染中继续进行增殖直到在 48 小时后达到汇合。(B) 转染及未转染细胞的汇合度面积百分比。效率使得干细胞保持健康，并在不诱导分化的情况下继续增殖。多能干细胞在持续的转染中继续进行增殖直到在 48 小时后达到近似汇合（图 3.5）。
图 3.5.Lipofectamine Stem 试剂可在转染过程中维持干细胞的健康与增殖。(A) 人 iPSC 培养于无饲养层的 Essential 8 培养基中，并采用 Lipofectamine Stem 试剂进行转染，附对照组（不转染）。细胞保持正常形态，且健康有活力，并在持续的转染中继续进行增殖直到在 48 小时后达到汇合。(B) 转染及未转染细胞的汇合度面积百分比。
在使用 Lipofectamine Stem 试剂进行转染后，PSC 可被连续传代并扩增，并同时维持其多能性。对照及转染后的 Gibco iPSC 在使用 Lipofectamine Stem 试剂将 GFP DNA 质粒转染至细胞内 48 小时后采用 Versene 溶液进行平行传代并重新接种于 6 孔板中，并在 StemFlex 培养基中继续扩增 4 天。它们随后被再次传代并扩增 3 天，达到 >75% 的汇合度后予以固定。在使用 Lipofectamine Stem 试剂转染并在 StemFlex 培养基中继续培养后，培养的细胞展现出了均一的细胞形态和一致的 Oct4 表达（图 3.6）。
图 3.6.PSC 在使用 Lipofectamine Stem 试剂转染并在 StemFlex 培养基中培养后仍保留有多能性标志物。(A) 将环状质粒 DNA 转染进 Gibco Episomal iPSC 并随后进行 2 次传代扩增。(B) 未转染的 Gibco Episomal iPSC。注意：Gibco iPSC 在接受环状质粒 DNA 转染并经历两次传代后仍保留有残余 GFP 表达（A，左图），同时在核内继续表达 Oct4 蛋白（A，中图），这与平行培养于 StemFlex 培养基中的未转染 Gibco iPSC 相似（B，中图）。
3.4 mRNA 转染
信使 RNA (mRNA) 一般会比 DNA 具有更高的转染效率，使其成为难转染干细胞的一种良好转染替代品。mRNA 的转染仅需进入细胞质中，而不需要转移至细胞核中进行转录。由于 mRNA 不需要入核，也就消除了整合至宿主基因组的风险，避免引起插入性突变以及癌基因的激活；此外，转染效率通常也会更高。更多的好处包括瞬时转染以及相对于 DNA 可更快实现蛋白表达。用 mRNA 进行转染是通过基因编辑以及转录因子引导的分化进行细胞基因型和表型操纵的一种有用平台。通过对转基因递送的时机、剂量以及化学计量的控制提供了一种驱动外源蛋白在干细胞中进行表达的精准方法。
正如图 3.7所示，Lipofectamine Stem 转染试剂对于微量 mRNA 展现出了出色的干细胞转染效率。
图 3.7.利用 Lipofectamine Stem 试剂实现人干细胞的高效 mRNA 转染。(A) H9 ESC 的实验条件。(B) 转染后 24 及 48 小时对细胞 GFP 表达进行检测。
3.5 RNP 复合物转染
诸如基因编辑等研究应用需要可将各种底物递送至细胞内的能力。Lipofectamine Stem 试剂可用于将 Cas9 蛋白与向导 RNA (gRNA) 的 RNP 复合物的共同递送以支持实现目标基因的高效插入/缺失 (indel)（图 3.8）。单链 DNA 构建体也可与 Cas9-mRNA、Cas9-gRNA 或 Cas9 蛋白-gRNA 进行混合以促进同源定向修复 (HDR) 并引入靶向基因组序列。
图 3.8.基于 Lipofectamine Stem 试剂的转染可支持干细胞中的高效基因编辑。(A) 人 iPSC 的实验条件。(B)（左）人 iPSC 中被共转染进 Cas9 mRNA、gRNA 以及 GFP mRNA（未显示）或靶向 EMX1 基因的 Cas9 RNP 以及 GFP mRNA。（右）转染后 48 小时分析 iPSC 中 EMX1 基因座的基因组切割检测。
对于特定的培养基系统，如 StemFlex 培养基，某些培养基成分可能会对基于脂质的转染存在抑制。对于这类培养基系统，以下工作流程可被用于利用 Lipofectamine Stem 试剂完成基于脂质的高效递送（图 3.9）。
图 3.9.将 Cas9 RNP 复合物利用 Lipofectamine Stem 试剂递送至培养于 StemFlex 培养基中的多能干细胞重叠法流程示意图。
更为详细的指导方法，可访问 thermofisher.com/lipofectaminestem
如图 3.10 及表 3.2 所示，使用之前的工作流程（图 3.9），利用 Lipofectamine Stem 试剂进行高效的 Cas9 RNP 复合物递送，借助 Invitrogen GeneArt 基因组切割检测 (GCD) 试剂盒可观察到 >40% 的切割或插入/缺失突变效率。通过免疫细胞化学技术对 PSC 中的 Oct4（一种细胞内多能性标志物）进行染色也表明 PSC 很好地维持了其多能性。
图 3.10.GeneArt 基因组切割检测试剂盒对切割效率进行分析。该检测是在 Gibco Human Episomal iPSC 中利用 Lipofectamine Stem 试剂进行 Cas9 RNP 复合物转染后 72 小时进行的。
有时，基于脂质的试剂溶液并不是一种切实可行的选择。因此，在这种情况下我们推荐使用 Invitrogen Neon 转染系统进行电穿孔。StemFlex 培养基是一种多功能培养基，还可支持 PSC 用于基于电穿孔的工作流程，并提供电穿孔后稳健的 PSC 恢复（图 3.11 及 3.14）、与基于电穿孔工作流程相关的更高切割效率（图 3.12）以及电穿孔和恢复后干细胞多能性的高效维持（图 3.13）。
图 3.11.电穿孔后表明培养于 StemFlex 培养基中的 iPSC 具有稳健恢复的代表性图像。
图 3.12.在靶向 HPRT 基因的 Cas9-gRNA 复合物经电穿孔后 ~72 小时 StemFlex 培养基中培养细胞的切割效率。
图 3.13.在电穿孔和恢复后培养于 StemFlex 培养基中的 iPSC 多能性维持。转染了靶向 HPRT 基因 Cas9-gRNA 复合物的细胞进行了 (A) Oct4 及 TRA-1-60 表达的免疫细胞化学定性分析以及 (B) 通过流式细胞分析进行的 Nanog 表达定量分析。
图 3.14.在通过电穿孔将 Cas9 质粒及供体质粒递送至 ESI-017 细胞后的细胞生长情况及活性。
有用的提示
- 除了在玻连蛋白上，PSC 还成功地在 rhLaminin-521 以及 Geltrex 基质上的 Essential 8 和 StemFlex 培养基中生长并转染。
- 用 Versene 溶液传代的 PSC 应当被打散至含有 3-5 个细胞的小细胞团。如果集落被打散成过大的细胞团（>10 个细胞），则只会在其外沿具有较好的转染效果。或者，按推荐将 TrypLE Select 酶与 StemFlex 培养基系统一起使用。
- Lipofectamine Stem 试剂复合物应当在 Gibco Opti-MEM I 减血清培养基中进行制备，并可直接加入至培养于含有或不含有血清培养基的干细胞。注意：对于 StemFlex 培养基培养的 PSC 需要采用重叠法。
- 虽然可能需要确定每种目的基因的 Cas9 RNP 转染（24-72 小时）形成最多插入/缺失所需的最佳时间，但不必去除转染复合物。如果细胞需要转染 48 小时，则应当在第二天向孔中额外加入等体积的 Essential 8 培养基，不会对转染造成干扰。对于 StemFlex 培养系统，推荐在转染后 24 小时移除复合物。
- 实现最佳转染的 Lipofectamine Stem 试剂用量取决于接种的干细胞量以及所用的 DNA 量（查看下方的建议用量）。
- 正在增殖的干细胞在转染时需要空间进行扩增，所以推荐按可在转染当天达到 30-60% 汇合度的起始细胞数进行接种。
- 使用较低量的 DNA、mRNA 或 RNP 复合物可产生更高的表达，并将因过量外源构建体及错误切割事件而引起的细胞毒性降低至最低。
- 如果观察到基于脂质的转染效果较差，则可采用 Neon 转染系统作为替代方法。
仅供科研使用，不可用于诊断目的。