Search Thermo Fisher Scientific
从 B-27 Plus 神经元培养系统到用于细胞分析的荧光探针
神经科学领域的传统培养和分析方法长期以来一直依赖于啮齿动物细胞模型系统来模拟高等哺乳动物神经网络活动的行为，旨在发现、表征和检测药物的安全性和毒理学。这些最易激发的有丝分裂后细胞类型通常从新鲜制备的组织中分离，或使用各种旨在重现天然或体内条件的培养基和细胞外基质制剂冻存用于后续研究。因此，控制质量的大批量冻存原代细胞类型的商业化供应有助于推进对大脑和神经功能的研究。目前还可获得专门开发用于在原代和诱导多能干细胞 (iPSC) 源性神经元的扩展培养中提高神经元存活率和增强神经元表型成熟的改进培养基配方，以及设计用于 2D 和 3D 神经元培养的功能探针。
推进细胞培养
在过去超过25年的时间中，研究人员一直依靠 Gibco B-27 添加剂和 Gibco Neurobasal 培养基开展神经元培养应用 [1]。原始无血清 B-27 添加剂专为大鼠海马和皮层神经元的长期培养而开发。但是，B-27 添加剂的发布历史表明，研究人员正在扩大其用途，远远超出了这些应用。iPSC 源性神经元的开发进展导致需要在比 B-27 添加剂和 Neurobasal 培养基设计支持时间更长的时间内保持更高的神经元密度。我们凭借在培养基方面数十年的经验，开发出了 Gibco B-27 Plus 神经元培养系统，这是一种无血清培养系统，可提高神经元存活率、加速神经突生长并改善神经元的电生理活动和成熟（图1）。
图1.显示小鼠皮层神经元培养使用 Gibco B-27 Plus 神经元培养系统，让冻存的 Gibco 原代小鼠皮层神经元在培养物中生长3周。用 Invitrogen NucBlue 固定细胞 ReadyProbes 试剂、抗 β-微管蛋白小鼠单克隆抗体联合 Invitrogen Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG 抗体和 Invitrogen ActinRed 555 ReadyProbes 试剂固定并标记细胞。将细胞固定在 Invitrogen ProLong 玻璃抗淬灭封片剂中，并在 Invitrogen EVOS FL Auto 2 成像系统上使用 60x 油浸物镜成像。
详细了解神经元亚型
B-27 Plus 神经元培养系统通过原材料和生产工艺升级以及较小的配方修改，改善了传统的培养环境。本文中，我们将了解改进的神经元培养条件如何影响原代神经元培养中的神经元亚群，以及亚群存活率和成熟度增强所带来的功能影响。来自啮齿动物大脑的神经元制备物含有不同类型的细胞，包括兴奋性（谷氨酸能）和抑制性（γ-氨基丁酸能）神经元，以及小清蛋白 (PV) 阳性的 γ-氨基丁酸能中间神经元亚群。在体内，兴奋性和抑制性神经元的数量受到严格调控，且它们的相互作用是神经网络调节的基础。此外，PV 中间神经元在控制网络间的同步活动方面发挥着重要作用。在体外，神经元存活率和稳健的成熟度对于原代皮层和海马培养物中神经元亚群维持以及形成网络化同步活动至关重要。
培养条件对兴奋性和抑制性大鼠皮层神经元亚群的影响如图2所示，其中比较了在经典 B-27 添加剂和 Neurobasal 培养基以及 B-27 Plus 系统中生长28天的培养物。通过 HuC/D 阳性细胞计数确定每种培养物中神经元的总数。我们采用神经元亚群特异性抗体，进一步将这些细胞表征为谷氨酸能神经元（VGLUT2 阳性）、γ-氨基丁酸能神经元（GABA 阳性）和 PV 阳性中间神经元。
在 Thermo Scientific CellInsight CX5 高内涵筛选 (HCS) 平台上进行的定量图像分析显示，B-27 Plus 系统中的 HuC/D 阳性细胞比经典 B-27 系统中多约 50%。此外，经典 B-27 系统中 90% 的神经元 VGLUT2 染色呈阳性，而 B-27 Plus 系统中为 81%，B-27 培养物中 12% 的神经元为 GABA 阳性神经元，而 B-27 Plus 系统中为 14%。值得注意的是，经典 B-27 系统中 PV 阳性中间神经元的百分比小于 1%，而 B-27 Plus 系统中为 7%。这些结果与体内皮层神经元 80% 谷氨酸能和 20% γ-氨基丁酸能的估计值一致。MAP2、GABA 和 PV 染色的定性分析表明，在 B-27 Plus 系统中培养的细胞中，成熟的神经突染色显著增加，表明神经元及其亚群的成熟增强。总而言之，这些数据表明 B-27 Plus 系统中神经元亚群的维持和成熟显著改善。
图2.确定原代大鼠神经元培养物中的神经元亚型。在经典 Gibco B-27 添加剂和 Gibco Neurobasal 培养基（上行图像）或 Gibco B-27 Plus 神经元培养系统（下行图像）中培养大鼠皮层神经元28天，然后针对 MAP2（绿色）和 HuC/D（红色）、VGLUT2（红色）、GABA（红色）或小清蛋白（红色）以及相应的 Invitrogen Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG 和 Alexa Fluor 594 驴抗鼠 IgG 和抗兔 IgG 二抗进行免疫染色。细胞核使用 DAPI（蓝色）进行标记。
2D 和 3D 培养中神经元成熟和分析面临的挑战
用神经培养系统产生有用数据的主要障碍之一是干细胞来源和原代培养物达到成熟以用于下游功能分析所需的时间。通常情况下，培养基必须每周更新 2-3 次，持续至少2周，才可在培养物中形成突触并出现稳定的网络。在 3D 培养环境下，这一挑战变得异常困难，必须小心地去除和更换培养基，不得扰动或意外抽吸由未成熟祖细胞形成的球形类器官。神经干细胞 (NSC) 源性培养物可能需要4周或更长时间才能对去极化刺激产生功能性反应，而形成突触则需要更长时间。
为了应对这些挑战，我们专门开发了 Neurobasal Plus 培养系统，以加快原代培养物的成熟速率，并增加在漫长的分化过程中存活下来的神经元的产量。此外，还设计了 Gibco CultureOne 添加剂，用于停止祖细胞的增殖，并将它们重定向至神经谱系，所需时间约为无添加剂培养所需时间的一半。使用 Neurobasal Plus 系统和 CultureOne 添加剂培养 NSC，可改善终末分化细胞的功能反应，这些细胞几乎完全不含祖细胞表型，且富含神经元特征标志物。
使用 CultureOne 添加剂的优势在 3D NSC 培养中尤为重要。为了形成 3D 神经元球体，在含和不含 CultureOne 添加剂的 Neurobasal 或 Neurobasal Plus 培养基中分化 NSC 2 周，然后用 Invitrogen Tubulin Tracker Deep Red 试剂染色以标记神经元突起。这种细胞可透过性试剂提供了一种远红外荧光微管蛋白选择性染料，只需单一染色和洗涤步骤。由于培养基更换和染色方案等都是 3D 培养方案的痛点，Tubulin Tracker Deep Red 试剂是一种理想的细胞分析工具，无需在分析前固定并透化球体（与免疫染色方案相比）。TubulinTracker Deep Red 染色和 Thermo Scientific CellInsight CX7 LZR 高内涵分析平台成像证明，与在不含添加剂的原始 Neurobasal 培养基中的生长情况相比，在含 CultureOne 添加剂的 Neurobasal Plus 培养基中培养的神经元球体表现出神经突生长增强（图3）。
随着神经元培养基的改进，3D 培养系统和支持物的最新开发进展增强了在更接近完整生物体中神经系统组织状态的基质中培养神经元的能力，而无需使用昂贵且耗时的动物模型。图3所示的神经元球体生长在 Thermo Scientific Nunclon Sphera 微孔板上，其表面的细胞粘附性非常低。Nunclon Sphera 微孔板可持续促进 3D 球体和类器官培养。赛默飞世尔科技提供一系列培养基、培养器皿、细胞分析试剂和荧光仪器，均旨在搭配用于 2D 和 3D 神经元细胞培养和分析。
点击图片放大
图3.用 Tubulin Tracker Deep Red 染色的 3D 神经元培养物。(A) 在 Thermo Scientific Nunclon Sphera 96U 孔微孔板中，使用含和不含 Gibco CultureOne 添加剂的 Gibco Neurobasal 培养基或 Gibco Neurobasal Plus 培养基培养神经元球体，然后用 Invitrogen Tubulin Tracker Deep Red 试剂染色。图像由 Thermo Scientific CellInsight CX7 高内涵分析 (HCA) 平台使用 10x 物镜生成。(B) 用 Tubulin Tracker Deep Red 和 Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes 试剂标记神经元球体。在添加丙磺舒的含钙、镁离子的 Gibco HBSS 中对细胞进行成像。图像由配有 20x 物镜和 Invitrogen EVOS Cy5 光立方的 Invitrogen EVOS FL Auto 2 成像系统生成。
了解更多
本文下载
下载本文章的可打印版本。
立即下载
仅供科研使用，不可用于诊断目的。