介绍

使用说明：

对于 Neurobasal 培养基，若要用于培养原代细胞，则在使用前必须添加 0.5 mM L-谷氨酰胺，若要用于培养神经元表型肿瘤细胞或神经干细胞，则在使用前必须添加 2.0 mM L-谷氨酰胺。此外，还需要添加无血清添加剂或血清。对于海马和其他 CNS 神经元，推荐使用 B-27 添加剂（货号号17504）。对于胚胎神经元，还建议在铺板步骤中添加 25 uM 谷氨酸。对于神经干细胞，推荐使用 N-2 添加剂（货号17502）或 B-27 添加剂（均不含视黄酸）
（货号12587）。对于胶质源性肿瘤细胞系，推荐使用 G-5（货号17503）。

预期用途

NEUROBASAL 货号21103 — 添加 B27 后，旨在优化大鼠胚胎海马神经元的生长和长期存活率1，以及胚胎大鼠纹状体、黑质、隔膜和皮层以及新生大鼠小脑和齿状回神经元的生长和存活率2。

NEUROBASAL 货号12348 — 专门用于受体研究（例如雌激素受体）、下游蛋白纯化研究或不希望存在酚红的其他工艺

NEUROBASAL-A 货号10888 — 同时补充 B272 和 β-FGF 后，旨在维持大鼠出生后和成年海马神经元的长期生长和活力。

  • 已经表明，NEUROBASAL-A 的渗透压非常适合出生后和成年 CNS 神经元。
  • NEUROBASAL 在补充 N23、B27 或血清后可有效促进神经元源性肿瘤细胞系的生长。


NEUROBASAL-A 货号12349 — 专门用于受体研究（例如雌激素受体）、下游蛋白纯化研究或不希望存在酚红的其他工艺

背景

在添加 B27（货号17504）的 NEUROBASAL 中，即使培养四 (4) 周后，大鼠胚胎海马神经元也呈现出色的长期活力，对于以 640/mm2 铺板的细胞，其活力超过 90%，
对于以 160/mm2 铺板的细胞，其活力超过 50%。对于近乎纯神经元种群，五 (5) 天时神经胶质细胞生长率降至 0.5% 以下1。

成年 CNS 神经元的生长需要具备以下条件：温和分离其众多连接、适合少突胶质细胞分离和神经元富集的密度梯度、充分的附着底物和专用生长培养基。Brewer1 已表明，使用添加了 B27 的 NEUROBASAL-A 和适当的分离方法，可以从任何年龄的大鼠中分离海马神经元的球状残余物，并促进轴突和树突状突起的再生。


Neurobasal 和 Neurobasal-A 必须添加 N2 或 B27 和 0.5 mM L-谷氨酰胺。初次进行胚胎原代海马神经元铺板时，建议在 NEUROBASAL 培养基中添加 25 μM (3.7 μg/mL) 谷氨酸。两种培养基都支持近乎纯神经细胞种群的生长，而无需使用星形胶质细胞饲养层。添加了 B27 的这两种培养基都含有抗氧化剂，可减少活性氧损伤，而且它们不含兴奋性氨基酸、谷氨酸和天冬氨酸，因此适用于对这些神经递质的研究。

实验方案 - 细胞铺板

  • a. 应整夜应用预先包被 50 μg/mL 多聚-D-赖氨酸水溶液 (135 kD, Sigma) 的高压灭菌玻璃盖玻片（直径 12 mm，Carolina Biological 的 Assistant 品牌），吸取，用水冲洗一次，然后干燥1小时。
  • b. 以所需所需浓度（即 90-320 个细胞/mm2）将细胞铺板于 60 - 150 μL NEUROBASAL-A/B27（出生后）或 NEUROBASAL/B27（出生前）中。
  • c. 铺板并孵育（环境氧含量和 5% CO2 是可接受的孵育条件，但优选 9% 氧气与 5% CO2）一小时后，快速取走盖玻片，排水并转移到 37°C 下24孔板上的 0.4 mL NEUROBASAL-A/B27 中。对于出生后神经元，吸出培养基，用温热的 NEUROBASAL-A 冲洗盖玻片一次，并为细胞补充添加了以下物质的 NEUROBASAL-A：B27、0.5 mM L-谷氨酰胺、1% 青霉素-链霉素（货号15070）和 5 ng/mL β-FGF（货号13256）。
  • d. 培养细胞超过4天时，在第3天或第4天移除一半培养基，并替换为现在含有 10 ng/mL β-FGF（出生后神经元）的等体积培养基。随后应将出生前神经元（4天）的培养基更换为不含谷氨酸的 NEUROBASAL，以减少培养过程中的谷氨酸毒性。对于神经母细胞瘤，在铺板和后续培养基更换时，培养基中均应包含谷氨酸。

通过添加 2-巯基乙醇（货号21985，浓度 25 μM 4），可改善海马神经元的长期存活率。

质控检测

NEUROBASAL — 检测配方的 pH 值、渗透压、内毒素以及是否存在细菌和真菌污染。在促生长和是否存在毒性方面，向该培养基中添加 B27，并使用 B104（神经母细胞瘤）细胞系通过生长测定法进行检测
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参考文献

  1. Brewer, G.J.Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.J Neurosci.Methods: in press 71: 145-158 (1997).

  2. Brewer, G.J., Torricelli, J.R., Evege, E.K. and Price,P.J.Optimized survival of hippocampal neurons in B27 supplemented NEUROBASAL .A new serum-free medium combination.J. Neurosci.Res.35: 567-576 (1993).Brewer, G.J.Serum-free B27/Neurobasal medium supports differential growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus.J. Neurosci.Res.42, 674-683 (1995).Price, P.J. and Brewer, G.J.Serum-free media for neural cell culture.Protocols for Neural Cell Culture, 3rd edition.Chapter19.Eds.S. Federaff and A. Richardson, Humana Press 255-264, (2001).

  3. Bottenstein, J.E.Defined Media For Dissociated Neural Cultures.In: Current Methods In Cellular Neurobiology 4:107-130 (J.L.Barker, ed.), John Wiley and Sons (1983).

  4. Grill, R.J., Jr., Pixley, S.K.2-Mercaptoethanol Is A Survival Factor For Olfactory, Cortical and Hippocampal Neurons In Short-term Dissociated Cell Culture.Brain Res.613:168-172 (1993).Ishii, K., Katayama, M., Hori, K., Yodoi, J., Nakanishi, T. Effects of 2- Mercaptoethanol on Survival and Differentiation of Fetal Mouse Brain Neurons Cultured In Vitro.Neurosci.Letters 163: 159-162 (1993).
3946           2006年9月10日