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引言

从原代组织获得单细胞悬液的常用方法是酶解聚。细胞暴露在酶中的时间要尽可能的短，以尽可能保持原有活性。下列步骤可以解聚整个组织，获得较高产量的有活性细胞 1。

从原代组织中进行细胞分离

TrypLE™ 产品

TrypLE™ 产品的配方可直接替代您现有的方案。下列通用步骤可用于去除培养皿中多种细胞系，同时保持细胞完整性。应根据经验确定各系统可采用的优化条件和浓度。

  1. 从培养瓶中慢慢倒出培养基。使用不含钙和镁的 5 ml Dulbecco 磷酸缓冲盐溶液 (D-PBS) 來冲洗培养瓶（Gibco 货号 14190）。慢慢倒出 D-PBS。
  2. 向培养瓶加入适量（即在 75 cm2 培养瓶中加入 2 ml）且预热的 TrypLE™。摇动容器，以完全覆盖细胞层。
  3. 37°C 下孵育直至细胞分离（每 5 分钟观察一次）。轻轻敲打容器以清除细胞。
  4. 用 2 至 5 ml 细胞培养生长培养基进行稀释，然后将细胞悬液转移至 15 ml 离心管中。
  5. 以 100 × g 离心 5 到 10 分钟。丢弃上清液，用 2 至 5 ml 新鲜生长培养基悬浮细胞沉淀。


胰蛋白酶

  1. 去掉多余的组织后，使用无菌手术刀或剪刀，将剩余组织切成 3-4 mm 的小块。将组织块重悬于不含钙和镁的平衡盐溶液中，进行洗涤。待组织块沉降，去除上清液。重复洗涤 2 到 3 次。
  2. 将盛有组织块的容器置于冰上，去除残留的上清液。在 不含钙和镁的平衡盐溶液中加入 0.25% 的胰蛋白酶（100 mg 组织加入 1 ml 胰蛋白酶）。
  3. 在 4°C 下孵育 6 至 18 小时，以大幅度地增加几乎没有胰蛋白酶活性的酶的渗透率。
  4. 慢慢倒出并丢弃组织块中的胰蛋白酶。将组织块以及残留胰蛋白酶在 37°C 下孵育 20 至 30 分钟。
  5. 向组织块中加入温热的完全培养基，用移液管上下吹吸轻轻分散组织。如果使用无血清培养基，还要加入大豆胰蛋白酶抑制剂。
  6. 通过无菌不锈钢丝网（100 至 200 µm）过滤细胞悬液，分散剩余组织。计数和接种细胞，进行培养。


胶原酶

  1. 使用无菌手术刀或剪刀，将组织切成 3-4 mm 的小块。使用 Hanks 平衡盐溶液 (HBSS) 洗涤组织块数次。
  2. 加入胶原酶（50 至 200 单位/ml，溶解在 HBSS 中）。
  3. 在 37°C 下孵育 4 至 18 小时。加入 3 mM CaCl2 可增加解离效率。
  4. 通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，将分散细胞和组织碎片与较大的组织块分开。如果需要进一步的解聚 ，在组织块中加入新鲜的胶原酶。
  5. 通过离心在 HBSS 中洗涤悬液数次。
  6. 将细胞沉淀重悬于培养基中。计数和接种细胞，进行培养。


分散酶

  1. 使用无菌手术刀或剪刀，将组织切成 3-4 mm 的小块。使用不含钙和镁的平衡盐溶液洗涤组织块数次。
  2. 加入分散酶（0.6 至 2.4 单位/ml，溶解在不含钙和镁的平衡盐溶液中）。
  3. 在 37°C 下孵育 20 分钟至数小时。
  4. 通过无菌不锈钢丝网或尼龙网过滤细胞悬液，将分散细胞和组织碎片与较大的组织块分开。如果需要进一步 的解聚，在组织块中加入新鲜的分散酶。
  5. 通过离心在平衡盐溶液中洗涤悬液数次。

参考文献

  1. Freshney, R. (1987) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, p. 117, Alan R. Liss, Inc., New York.