出生前原代海马和皮层神经元的分离和消化

已发现下述程序对18天妊娠大鼠海马和神经母细胞瘤细胞系有效。

1. 使用 0.05 mg/mL 的多聚-D-赖氨酸 (MW 30,000–70,000) 溶液包被培养容器，并孵育一 (1) 小时或整夜。
   备注：  使用 0.15 mL/cm² 多聚-D-赖氨酸。多聚-D-赖氨酸溶液储存在 -20°C 的聚碳酸酯试管中。应预先筛选多聚-D-赖氨酸的毒性。
2. 用细胞培养级无菌水洗涤容器。
   备注：  容器可立即使用或在 4-10°C 的无菌蒸馏水中储存最长两 (2) 周。如果要储存容器，请在使用前约一 (1) 小时将水移除
3. 向 NEUROBASAL 培养基中添加 0.5 mM L-谷氨酰胺、25 µM 谷氨酸和 2% B27 或 1% N2 添加剂。
   
   • 如果使用 N2 添加剂，则在添加细胞之前，将最终浓度为 5–10 µg/mL 的人血浆纤连蛋白（货号33016）直接添加到培养基中或用 0.5–1.0 mg/mL 的牛玻连蛋白（货号12165）替代纤连蛋白。立即倾斜容器，确保均匀分布。
     备注： 补充 B27 后，通常无需添加纤连蛋白或玻连蛋白
   • 要制备人纤连蛋白：取 5 mg 复溶于 6.75 mL 无菌蒸馏 H₂0 中，制得 740 μg/mL 储备液。每 5 mL 培养基添加 50 μL 储备液，使得最终浓度为 7.4 μg/mL
4. 对于原代海马神经元（即来自18天妊娠 Sprague-Dawley 大鼠）及其他胎仔神经元
   • 在使用戊巴比妥钠麻醉剂条件下通过剖宫产获得胚胎，并解剖所需区域。
   • 在 1 mL Hanks 平衡盐溶液中研磨10次以分离单个细胞，该溶液（货号14175）不含 Ca++ 和 Mg++并补充了 1.0 mM 丙酮酸钠（货号11360）和 10 mM HEPES（货号15630），pH 值7.4，使用的是吸头仅仅经过火焰抛光的9英寸硅化巴斯德吸管。
   • 使用补充了上述物质的2倍体积的 HBSS（货号14025）进行稀释，可恢复二价阳离子。
   
   

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