介绍

Dynabeads 大鼠抗小鼠 IgM 与小鼠 IgM 一抗相结合,非常适用于去除或阳性分离不同物种(例如人、大鼠)的细胞,具体取决于一抗的特异性。可直接分离任何样本(如全血、骨髓、MNC 悬浮液或组织消化物)中的细胞。

分离原理
在分离细胞前,将小鼠 IgM 一抗添加到细胞样本中(间接技术)或预包被到微珠上(直接技术)。

然后将 Dynabeads 与试管中的细胞样本混合。Dynabeads 将在短暂的孵育过程中结合靶细胞,然后用磁铁分离微珠结合细胞。

  • 阳性分离 – 丢弃上清液并将微珠结合细胞用于下游应用(如分子分析、细胞培养)。
  • 去除 – 丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触细胞用于任何应用。

材料描述
Dynabeads 大鼠抗小鼠 IgM 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠(直径 4.5 μm),包被了小鼠 IgM 抗体。包被到 Dynabeads 上的抗体可识别小鼠免疫球蛋白的 μ 重链。与兔、猪或人 IgG 无交叉反应。与鸡、山羊、绵羊、牛、马、狗、狒狒 IgG 和人 IgM 的交叉反应性较低。

提供的材料

  • 5 mL Dynabeads 大鼠抗小鼠 IgM
  • 以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN3) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供,浓度为 4 x 108 个微珠/mL。

本产品将处理多达 2 x 109 个细胞。

所需的其他材料

  • 磁铁 (Dynal MPC™):有关磁铁建议,请访问 www.lifetechnologies.com/magnets-selection
  • 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
  • 缓冲液1:含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS,pH 7.4。
  • 小鼠 IgM 抗体。

重要提示:

  • BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或 FCS 代替。
  • EDTA 可用 0.6% 柠檬酸钠代替。
  • 不建议使用含 Ca2+ 或 Mg2+ 的 PBS。

方案

Dynabeads 洗涤程序

使用前,应先洗涤 Dynabeads。

  1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。
  2. 将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。
  3. 加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。
  4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。
  5. 从磁铁中取出试管,在体积与 Dynabeads 初始体积(第2步)相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。 


样本制备

可直接分离任何样本(如全血、骨髓、MNC 或组织消化物)中的细胞。有关推荐的样本制备程序,请访问 www.lifetechnologies.com/cellisolation 并点击我们的快速链接。

细胞分离的关键步骤

使用可以倾斜和旋转试管的混合器,确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。

  • 孵育 Dynabeads 和细胞时,孵育温度必须介于 2-8°C 之间,以减少吞噬活性和其他代谢过程。
  • 对于每 mL 细胞样本,切勿使用少于 25 μL (1 x 107) Dynabeads,每个靶细胞应至少对应4个 Dynabeads。


表1:每 mL 细胞样本添加的 Dynabeads 体积。可以根据需要增加体积。

 阳性分离去除
样本体积(1 x 107 个细胞/mL*)1 mL,至多 2.5 x 106 个靶细胞1 mL,至多 2.5 x 106 个靶细胞
Dynabeads 体积25 μL50 μL


* 如果细胞浓度增加或靶细胞浓度超过 2.5 x 106,必须相应增加 Dynabeads 体积。细胞浓度可高达 1 x 108 个细胞/mL。

细胞分离 – 间接技术

使用小鼠 IgM 抗体标记细胞

  • 每 106 个靶细胞使用约 1 mg 抗体。
  • 推荐的细胞浓度:1 x 107 个细胞/mL。
  1. 向细胞悬液中加入小鼠 IgM 抗体。混合均匀并在 2-8°C 下孵育20分钟。
  2. 每 1 x 107 个细胞加入 2 mL 缓冲液1来洗涤细胞,然后以 300 x g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。
  3. 以 1 x 107 个细胞/mL 的浓度在缓冲液1中重悬细胞。


分离或去除细胞

  1. 根据表1向制备的样本中添加 Dynabeads。
  2. 在 2-8°C 下孵育20分钟(阳性分离)或30分钟(去除),同时轻轻倾斜和旋转试管。
  3. 使用双倍体积的缓冲液1,以减少未结合细胞的滞留(可选)。
  4. 将试管放入磁铁2分钟。
  5. 去除:将含有未结合细胞的上清液转移到新试管中,供进一步实验使用。
  6. 阳性分离:使用下列程序丢弃上清液并轻轻洗涤微珠结合细胞4次:

  7.             i) 每 1 x 10 7 个 Dynabeads 添加 1 mL 缓冲液1。
                ii) 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。


细胞分离 – 直接技术

预包被 Dynabeads

每 25 μL (1 x 107) Dynabeads 使用 0.5-1.5 μg 小鼠 IgM 抗体。 

  1. 将洗过的 Dynabeads 转移到试管中。
  2. 加入抗体。
  3. 孵育 ≥ 30 分钟,同时轻轻倾斜和旋转试管。
  4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。
  5. 使用 2 mL 缓冲液1洗涤微珠两次。
  6. 从磁铁中取出试管,在体积与 Dynabeads 初始体积相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。 


分离或去除靶细胞

  1. 根据表1向细胞中加入预包被的 Dynabeads。
  2. 在 2-8°C 下孵育20分钟(阳性分离)或30分钟(去除),同时轻轻倾斜和旋转试管。
  3. 使用双倍体积的缓冲液1,以减少未结合细胞的滞留(可选)。
  4. 将试管放入磁铁2分钟。
  5. 去除:将含有未结合细胞的上清液转移到新试管中,供进一步实验使用
  6. 阳性分离:使用下列程序丢弃上清液并轻轻洗涤微珠结合细胞4次:

            i) 每 1 x 107 个 Dynabeads 添加 1 mL 缓冲液1。
            ii) 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  7.  在缓冲液/培养基中重悬细胞以用于下游应用。

技术建议

直接技术与间接技术的比较

在以下情况下,请使用间接技术:

  • 使用了小鼠 IgM 抗体的混合物。
  • 需要非常高的去除效率。
  • 小鼠 IgM 抗体的亲和力较低。
  • 细胞表达少量靶抗原。
  • 直接技术带来的纯度不能令人满意。


在以下情况下,可以使用直接技术:

  • 一抗的亲和力较高。
  • 细胞表达大量靶抗原。
  • 包被了一抗的 Dynabeads 需要备料。


抗体选择
一抗的选择是成功分离细胞的最重要因素。请注意,尽管一些抗体在其他免疫学检测中获得了不错的结果,但包被到微珠上时(直接技术),这些抗体的抗原结合效率可能降低。 

使用 IgM 抗体标记细胞

  • 用滴定法测量一抗以优化用量。
  • 为了避免细胞聚集,建议使用 γ 球蛋白或 Fc 阻断试剂。
  • 分离细胞前,必须通过洗涤去除过量的抗体。


分离和去除靶细胞

  • 去除密度梯度培养基(例如,Ficoll):在加入小鼠 IgM 抗体或 Dynabeads 前洗涤细胞。
  • 去除血清中的可溶性因子:血清可能含有可溶性因子(例如抗体、细胞表面抗原),它们会干扰细胞分离方案。洗涤细胞一次可以减少这种干扰。

基本信息

Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

储存/稳定性
如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下,在标签上注明的失效日期前,本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中,始终让 Dynabeads 处于悬浮液中,因为干燥会导致性能降低。使用前,请充分重悬。

警告和限制
本产品仅用于研究目的。除非另有说明,否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠(作为防腐剂,具有细胞毒性)。

不要用嘴吹打!
叠氮化钠可与铅和铜管发生反应,形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时,请用大量水冲洗,以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

参考文献

  1. Estes JD et al (2004) Follicular Dendritic Cell Regulation of CXCR4-Mediated Germinal Center CD4 T Cell Migration1.J. Immunol.173: 6169– 6178.
  2. Nikolov EN and Ivanova-Nikolova T (2004) Coordination of Membrane Excitability through a GIRK1 Signaling Complex in the Atria.J. Biol.Chem.279 (22): 23630–23636.
  3. Test ST et al (2005) Depletion of Complement Has Distinct Effects on the Primary and Secondary Antibody Responses to a Conjugate of Pneumococcal Serotype 14 Capsular Polysaccharide and a T-Cell-Dependent Protein Carrier.Infection and Immunity, 73: 277–286.
110.39D.indd   版本002    2007年5月5日

仅供科研使用,不可用于诊断目的。