介绍

Dynabeads 绵羊抗小鼠 IgG 与小鼠一抗相结合,非常适用于去除或阳性分离不同物种(例如人)的细胞,具体取决于一抗的特异性。可直接分离任何样本(如全血、骨髓、MNC 悬浮液或组织消化物)中的细胞。

多克隆绵羊抗小鼠 IgG 抗体会结合小鼠 IgG1、IgG2a 和 IgG2b 的重链和轻链。它们也会结合所有同种型(如 IgG3 和 IgM)小鼠免疫球蛋白的轻链,不过反应性较低。

备注:
   Dynabeads ClinExVivo™ 绵羊抗小鼠 IgG(货号 422.01)可用于体外分离人类细胞,以进行基于细胞的临床研究。

分离原理

在分离细胞前,将小鼠一抗添加到细胞样本中(间接技术)或预包被到微珠上(直接技术)。然后将 Dynabeads 与试管中的细胞样本混合。Dynabeads 将在短暂的孵育过程中结合靶细胞,然后用磁铁分离微珠结合细胞。

  • 阳性分离 – 丢弃上清液并将微珠结合细胞用于下游应用(如分子分析或细胞培养)。
  • 去除 – 丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触细胞用于任何应用。


材料描述

Dynabeads 绵羊抗小鼠 IgG 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠(直径 4.5 μm),包被了多克隆绵羊抗小鼠 IgG 抗体。多克隆抗体通过亲和作用吸附到表面,以降低与人免疫球蛋白的交叉反应性。与大鼠抗体的交叉反应性较高。

提供的材料

5 mL Dynabeads 绵羊抗小鼠 IgM 

以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN3) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供,浓度为 4 x 108 个微珠/mL。

本产品将处理多达 2 x 109 个细胞

所需的其他材料

不包含但执行整个方案需要的材料:

  • 磁铁 (Dynal MPC™):有关磁铁建议,请访问 www.lifetechnologies.com/magnets-selection
  • 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
  • 缓冲液1:含 0.1% BSA 的 PBS,pH 7.4。
  • 小鼠单克隆抗体。

方案

Dynabeads 洗涤程序

使用前,应先洗涤 Dynabeads。

  1. 在小瓶中重悬 Dynabeads。

  2.  将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。

  3. 加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。

  4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  5. 从磁铁中取出试管,在体积与 Dynabeads 初始体积(第2步)相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。 


样本制备

可直接分离任何样本(如全血、骨髓、MNC 或组织消化物)中的细胞。有关推荐的样本制备程序,请访问 www.lifetechnologies.com/cellisolation 并点击我们的快速链接。

细胞分离的关键步骤

使用可以倾斜和旋转试管的混合器,确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。

  • 孵育 Dynabeads 和细胞时,孵育温度必须介于 2-8°C 之间,以减少吞噬活性和其他代谢过程。
  • 对于每 mL 细胞样本,切勿使用少于 25 μL (1 x 107) Dynabeads,每个靶细胞应至少对应4个 Dynabeads


表1:每 mL 细胞样本添加的 Dynabeads 体积。可以根据需要增加体积。

 阳性分离去除
样本体积(1 x 107 个细胞/mL*)1 mL 1 mL 
Dynabeads 体积25 μL50 μL
每份产品处理的
细胞总数

2 x 109 个细胞

1 x 109 个细胞


*如果细胞浓度增加,必须相应增加 Dynabeads 体积。细胞浓度可高达 1 x 108 个细胞/mL。

细胞分离 – 间接技术

使用小鼠 IgM 抗体标记细胞

每 106 个靶细胞使用约 1 μg 一抗(小鼠 IgG)。

  • 推荐的细胞浓度:1 x 107 个细胞/mL。

 

  1. 向细胞悬液中加入一抗并混合。

  2. 在 2-8°C 下孵育10分钟。

  3. 每 1 x 107 个细胞加入 2 mL 缓冲液1来洗涤细胞,然后以 300 x g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。

  4. 以 1 x 107 个细胞/mL 的浓度在缓冲液1中重悬细胞。

  5. 继续分离或去除细胞


分离或去除细胞

  1. 根据表1向制备的样本中添加 Dynabeads。

  2. 在 2-8°C 下孵育20分钟(阳性分离)或30分钟(去除),同时轻轻倾斜和旋转试管。

  3. 使用双倍体积的缓冲液1,以减少未结合细胞的滞留(可选)。

  4. 将试管放入磁铁2分钟。

  5. 去除:将含有未结合细胞的上清液转移到新试管中,供进一步实验使用。

  6. 阳性分离:使用下列程序丢弃上清液并轻轻洗涤微珠结合细胞4次:

  7. 7




  8. 在缓冲液/培养基中重悬细胞以用于下游应用。



细胞分离 – 直接技术

预包被 Dynabeads

  • 每 25 μL (1 x 107) Dynabeads 使用 0.5-1.5 μg 一抗(小鼠 IgG)。需要用滴定法测量抗体量。

 

  1. 将洗过的 Dynabeads 转移到试管中。

  2. 加入抗体。

  3. 在 2-8°C 下孵育 ≥ 30 分钟,同时轻轻倾斜和旋转试管。

  4. 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  5. 使用 2 mL 缓冲液1洗涤微珠两次。

  6. 从磁铁中取出试管,在体积与 Dynabeads 初始体积相同的缓冲液1中重悬 Dynabeads。


分离或去除细胞

  1. 根据表1向细胞中加入预包被的 Dynabeads。

  2. 在 2-8°C 下孵育20分钟(阳性分离)或30分钟(去除),同时轻轻倾斜和旋转试管。

  3. 使用双倍体积的缓冲液1,以减少未结合细胞的滞留(可选)。

  4. 将试管放入磁铁2分钟。

  5. 去除:将含有未结合细胞的上清液转移到新试管中,供进一步实验使用。

  6. 阳性分离:使用下列程序丢弃上清液并轻轻洗涤微珠结合细胞4次:


            i) 每 1 x 107 个 Dynabeads 添加 1 mL 缓冲液1。

           ii) 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  7.   在缓冲液/培养基中重悬细胞以用于下游应用。

技术建议

直接技术与间接技术的比较

在以下情况下,请使用间接技术:

  • 使用了小鼠单克隆抗体的混合物。
  • 需要非常高的去除效率。
  • 小鼠抗体的亲和力较低。
  • 细胞表达少量靶抗原。
  • 直接技术带来的纯度不能令人满意。


在以下情况下,可以使用直接技术:

  • 一抗的亲和力较高。
  • 细胞表达大量靶抗原。
  • 包被了一抗的 Dynabeads 需要备料。


抗体选择

一抗的选择是成功分离细胞的最重要因素。请注意,尽管一些抗体在其他免疫学检测中获得了不错的结果,但包被到微珠上时(直接技术),这些抗体的抗原结合效率可能降低。

使用 IgM 抗体标记细胞

  • 用滴定法测量一抗以优化用量。
  • 为避免非特异性结合细胞(例如单核细胞、B 细胞),在加入一抗前,先加入聚集 IgG 以阻断 Fc 受体。


分离和去除靶细胞

  • 去除密度梯度培养基(例如 Ficoll):在加入小鼠 IgM 抗体或 Dynabeads 前洗涤细胞。
  • 去除血清中的可溶性因子:血清可能含有可溶性因子(例如抗体或细胞表面抗原),它们会干扰细胞分离方案。洗涤细胞一次可以减少这种干扰。

基本信息

Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

储存/稳定性

如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下,在标签上注明的失效日期前,本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中,始终让 Dynabeads 处于悬浮液中,因为干燥会导致性能降低。使用前,请充分重悬。

警告和限制

本产品仅用于研究目的。除非另有说明,否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠(作为防腐剂,具有细胞毒性)。

不要用嘴吹打!

叠氮化钠可与铅和铜管发生反应,形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时,请用大量水冲洗,以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

参考文献

  1. Anjuère F et al.(2004) In vivo adjuvant-induce mobilization and maturation of gut dendritic cells after oral administration of Cholera toxin.J. Immunol.173: 5103-5111.

  2. Chai JG et al.(2000) CD152 ligation by CD80 on T cells is required for the induction of unresponsiveness by costimulation deficient antigen presentation.J. Immunol.165: 3037-3042.

  3. Delneste Y et al.(2003) Interferon-g switches monocyte differentiation from dendritic cells to macrophages.Blood 101: 143-150.

  4. Gutiérrez-Frías C et al.(2004) Sonic hedgehog regulates early human thymocytes differentiation by counteracting the IL-7-induced development of CD34+ precursor cells.J. Immunol.173: 5046-5053.

  5. Hall A et al.(2004) Rh Autoantigen presentation to helper T cells in chronic lymphocytic leukemia by malignant B-cells.Blood.Jul 29 [Epub ahead of print].

  6. Ho LH et al.(2004) Labile zinc and zinc transporter ZnT4 in mast cell granules: Role in regulation of caspas  activation and NF-kB translocation.J. Immunol.172: 7750-7760.

  7. Inobe M et al.(2004) CTLA-4 engagement acts as a brake on CD4+ T cell proliferation and cytokine production but is not required for tuning T cell reactivity in adaptive tolerance.J. Immunol.173: 7239-7248.

  8. Jaleco S et al.(2003) Homeostasis of naïve and memory CD4+ T cells: IL-2 and IL-7 differentially regulate the balance between proliferation and Fas-mediated apoptosis.J.Immunol.171: 61-68.

  9. Kawamura T et al.(2003) Decreased stimulation of CD4+ T cell proliferation and IL-2 production by highly enriched populations of HIV-infected dendritic cells.J. Immunol.170: 4260- 4266.

  10. Liu DY et al.(2002) An anti-actin monoclonal antibody inhibits the zona pellucida-induced acrosome reaction and hyperactivated motility of human sperm.Mol.Human Reproduction.8(1): 37-47.

  11. Mackay G et al.(2004) Protection against lateonset AIDS in macaques prophylactically immunized with a live simian HIV vaccine was dependent on persistence of the vaccine virus.J. Immunol.173: 4100-4107.

  12. Pater-Huijsen FL et al.(2002) Products from human mast cell lines cells enhance the production of interferon-gamma by CD8(+) and CD4(+) T cells.Immunology 106(1):11-19.

  13. Pollara G et al.(2004) Herpes Simplex virus type-1 induced activation of myeloid dendritic cells: the roles of virus cell interaction and paracrine type I IFN secretion.J. Immunol.173: 4108-4119.

  14. Sompuram SR et al.(2002) Synthetic peptides identified from phage-displayed combinatorial libraries as immunodiagnostic assay surrogate quality-control targets.Clin.Chemistry 48(3): 410-420.

  15. Strom TS et al.(2003) Defects in T cell-mediated immunity to influenza virus in murine Wiskott-Aldrich syndrome are corrected by oncoretroviral vector-mediated gene transfer into repopulating hematopoietic cells.Blood 102: 3108-3116.

  16. Wang JCE et al.(2003) Cutting edge: CD4+ T cell help can be essential for primary CD8+ T cell responses in vivo.J. Immunol.171: 6339-6343.

  17. Weissman D et al.(2000) HIV gag mRNA transfection of dendritic cells (DC) delivers encoded antigen to MHC class I and II molecules, causes DC maturation, and induces a potent human in vitro primary immune response.J. Immunol.165: 4710-4717.

  18. Xystrakis E et al.(2004) Functional and genetic analysis of two CD8 T cell subsets defined by the level of CD45RC expression in the rat.J. Immunol.173: 3140-3147.

  19. Martinez del Hoyo G et al.(2006) Prion Protein Expression by Mouse Dendritic Cells Is Restricted to the Nonplasmacytoid Subsets and Correlates With the Maturation State.J Immunol.177:6137-6142.

  20. Shannon-Lowe C et al.(2005) Epstein-Barr virus- induced B-cell transformation: quantitating events from virus binding to cell outgrowth.J Gen Virol.56:3009-3019.

  21. Omidvar N et al.(2006) Expression of Glycosylphosphatidylinositol- Anchored CD59 on Target Cells Enhances Human NK Cell-Mediated Cytotoxicity.J Immunol.176:2915-2923.

  22. Grigoriadis A et al.(2006) Establishment of the epithelial-specific transcriptome of normal and malignant human breast cells based on MPSS and array expression data.Breast Cancer Res.8:R56.

  23. Ohyama M et al.(2006) Characterization and isolation of stem cell-enriched human hair follicle bulge cells.J Clin Invest.116:249-260.

 

110.31.indd   版本002    2008年5月5日

仅供科研使用,不可用于诊断目的。