绵羊抗大鼠 IgG – 去除或阳性分离不同物种的细胞

Dynabeads 绵羊抗大鼠 IgG 与任何大鼠 IgG 一抗相结合，非常适用于去除或阳性分离不同物种（例如小鼠）的细胞，具体取决于一抗的特异性。可直接分离任何样本（如全血、骨髓、MNC 悬浮液或组织消化物）中的细胞。

分离原理
在分离细胞前，将大鼠 IgG 一抗添加到细胞样本中（间接技术）或预包被到微珠上（直接技术）。然后将 Dynabeads 与试管中的细胞样本混合。Dynabeads 将在短暂的孵育过程中结合靶细胞，然后用磁铁分离微珠结合细胞。

• 阳性分离 – 丢弃上清液并将微珠结合细胞用于下游应用（如分子分析、细胞培养）。
• 去除 – 丢弃微珠结合细胞并将剩余的未接触细胞用于任何应用。

材料描述
Dynabeads 绵羊抗大鼠 IgG 是均匀的超顺磁性聚苯乙烯微珠（直径 4.5 μm），包被了多克隆绵羊抗大鼠 IgG 抗体。与小鼠抗体的交叉反应性较高，与人抗体的交叉反应性极低。

提供的材料

• 5 mL Dynabeads 绵羊抗大鼠 IgG，以 pH 7.4、含 0.1% 牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.02% 叠氮化钠 (NaN₃) 的磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的形式提供，浓度为 4 x 10⁸ 个微珠/mL。
• 本产品将处理多达 2 x 10⁹ 个细胞。

所需的其他材料

• 磁铁：(Dynal MPC™) - MPC-S 适用于 20 μL 至 2 mL 样本，MPC-L 适用于 1-8 mL 样本，MPC-15 适用于 1-15 mL 样本，MPC-50 适用于 15-50 mL 样本。
• 兼具倾斜和旋转功能的混合器。
• 缓冲液1：含 0.1% BSA 和 2 mM EDTA 的 PBS（不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺），pH 7.4。

重要提示：
BSA 可用人血清白蛋白 (HSA) 或胎牛血清 (FCS) 代替。EDTA 可用柠檬酸钠代替。不建议使用含 Ca²⁺ 或 Mg²⁺ 的 PBS。

Dynabeads 洗涤程序
使用前，应先洗涤 Dynabeads。磁铁的使用令洗涤程序更加容易。

  1.   在小瓶中重悬 Dynabeads。
  2.   将所需体积的 Dynabeads 转移至试管中。
  3.   加入相同体积或至少 1 mL 的缓冲液1并混合。
  4.   将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。
  5.   从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积相同的缓冲液1中重悬洗过的 Dynabeads。

样本制备
可直接分离任何样本（如全血、骨髓、MNC 悬浮液或组织消化物）中的细胞。有关推荐的样本制备程序的列表，请访问 www.lifetechnologies.com/samplepreparation。

细胞分离的关键步骤
使用可以倾斜和旋转试管的混合器，确保 Dynabeads 不会沉淀在管底。孵育 Dynabeads 和细胞时，孵育温度必须介于 2-8°C 之间，以减少吞噬活性和其他代谢过程。对于每 mL 细胞样本，切勿使用少于 25 μL (1 x 10⁷) Dynabeads，每个靶细胞应至少对应4个 Dynabeads。

表1：每 mL 细胞样本添加的 Dynabeads 体积。可以根据需要增加体积。

* 如果细胞浓度增加或靶细胞浓度超过 2.5 x 10⁶，必须相应增加 Dynabeads 体积。细胞浓度可高达 1 x 10⁸ 个细胞/mL。

细胞分离 – 间接技术
使用大鼠 IgG 抗体标记细胞
每 10⁶ 个靶细胞使用约 1 μg 抗体。

• 推荐的细胞浓度：1 x 10⁷ 个细胞/mL。

  1.   向细胞悬液中加入大鼠 IgG 抗体并混合。
  2.   在 2-8°C 下孵育20分钟。
  3.   每 1 x 10⁷ 个细胞加入 2 mL 缓冲液1来洗涤细胞，然后以 300 x g 的速度离心8分钟。丢弃上清液。
  4.   以 1 x 10⁷ 个细胞/mL 的浓度在缓冲液1中重悬细胞。
  5.   继续分离或去除细胞。

分离或去除细胞
  1.   根据表1向制备的样本中添加 Dynabeads。
  2.   在 2-8°C 下孵育20分钟（阳性分离）或30分钟（去除），同时轻轻倾斜和旋转试管。
  3.   使用双倍体积的缓冲液1，以减少未结合细胞的滞留（可选）。
  4.   将试管放入磁铁2分钟。
  5.   去除：将含有未结合细胞的上清液转移到新试管中，供进一步实验使用。
  6.   阳性分离：使用下列程序丢弃上清液并轻轻洗涤微珠结合细胞4次：
            i) 每 1 x 10⁷ 个 Dynabeads 添加 1 mL 缓冲液1。
           ii) 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。

  7.   在缓冲液/培养基中重悬细胞以用于下游应用。

细胞分离 – 直接技术

预包被 Dynabeads

• 每 25 μL (1 x 10⁷) Dynabeads 使用 0.5-1.5 μg 大鼠 IgG 抗体。（建议用滴定法测量抗体量。）

  1.   将洗过的 Dynabeads 转移到试管中。
  2.   加入大鼠 IgG 抗体。
  3.   在 2-8°C 下孵育 ≥ 30 分钟，同时轻轻倾斜和旋转试管。
  4.   将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。
  5.   使用 2 mL 缓冲液1洗涤微珠两次。
  6.   从磁铁中取出试管，在体积与 Dynabeads 初始体积相同的缓冲液1中重悬 Dynabeads。

分离或去除细胞
  1.   根据表1向细胞中加入预包被的 Dynabeads。
  2.   在 2-8°C 下孵育20分钟（阳性分离）或30分钟（去除），同时轻轻倾斜和旋转试管。
  3.   使用双倍体积的缓冲液1，以减少未结合细胞的滞留（可选）。
  4.   将试管放入磁铁2分钟。
  5.   去除：将含有未结合细胞的上清液转移到新试管中，供进一步实验使用。
  6.   阳性分离：使用下列程序丢弃上清液并轻轻洗涤微珠结合细胞4次：
            i) 每 1 x 10⁷ 个 Dynabeads 添加 1 mL 缓冲液1。
           ii) 将试管放入磁铁1分钟并丢弃上清液。
  7.   在缓冲液/培养基中重悬细胞以用于下游应用。

直接技术与间接技术的比较

在以下情况下，请使用间接技术：

• 使用了大鼠 IgG 抗体的混合物。
• 需要非常高的去除效率。
• 大鼠 IgG 抗体的亲和力较低。
• 细胞表达少量靶抗原。
• 直接技术带来的纯度不能令人满意。

在以下情况下，可以使用直接技术：

• 一抗的亲和力较高。
• 细胞表达大量靶抗原。
• 包被了一抗的 Dynabeads 需要备料。

抗体选择
一抗的选择是成功分离细胞的最重要因素。请注意，尽管一些抗体在其他免疫学检测中获得了不错的结果，但包被到微珠上时（直接技术），这些抗体的抗原结合效率可能降低。

使用大鼠 IgG 抗体标记细胞

• 为避免非特异性结合细胞（例如单核细胞、B 细胞），在加入一抗前，先加入聚集 IgG 以阻断 Fc 受体。

• 分离细胞前，必须通过洗涤去除过量的抗体。

分离和去除靶细胞

• 去除密度梯度培养基（例如，Ficoll）：在加入大鼠 IgG 抗体或 Dynabeads 前洗涤细胞。
• 去除血清中的可溶性因子：血清可能含有可溶性因子（例如抗体或细胞表面抗原），它们会干扰细胞分离方案。洗涤细胞一次可以减少这种干扰。

Invitrogen Dynal AS 符合质量体系标准 ISO 9001:2000 和 ISO 13485:2003。

储存/稳定性
如在未开封的情况下储存于 2-8°C 下，在标签上注明的失效日期前，本产品可一直保持稳定。请在 2-8°C 下储存已开封的小瓶并避免细菌污染。在储存期间和所有操作步骤中，始终让 Dynabeads 处于悬浮液中，因为干燥会导致性能降低。使用前，请充分重悬。

警告和限制
本产品仅用于研究目的。除非另有说明，否则不得用于任何动物或人的治疗或诊断。请遵循适当的实验室指南。本产品含有 0.02% 叠氮化钠（作为防腐剂，具有细胞毒性）。

不要用嘴吹打！
叠氮化钠可与铅和铜管发生反应，形成极易爆炸的金属叠氮化物。通过管道排放进行处置时，请用大量水冲洗，以防止叠氮化物积聚。分析证书 (CoA) 可应要求提供。材料安全数据表 (MSDS) 可在 获得。

1. Philippe D et al.(2003) Anti-inflammatory properties of the m opioid receptor support its use in the treatment of colon inflammation.J.Clin.Invest.111:1329-1338.
2. Feng B et al.(2000) Development of mouse dendritic cells from lineage-negative c-kitlow pluripotent hemopoieitic stem cells in vitro.Stem Cells.18:53-60.
3. Zhou P et al.(2004) Expression of dual TCR on DO11.10 T cells allows for ovalbumin-induced oral tolerance to prevent T cell-mediated colitis directed against unrelated enteric antigens.J. Immunol.172:1515-1523.
4. Yeh JRJ et al.(2000) The anti-angiogenic agent TNP-470 requires P53 and P21^CIP/WAF for endothelial cell growth arrest.PNAS 97(23): 12782-12787.
5. Na Nakorn T et al.(2002) Characterization of mouse clonogenic megakaryocyte progenitors.PNAS 100(1):205-210.
6. Steptoe RJ et al.(2003) Transfer of hematopoietic stem cells encoding auto-antigen prevents autoimmune diabetes.J.Clin.Invest.111:1357–1363.
7. Tanchot C et al.(2004) Immune regulation by self-reactive T cells is antigen-specific.J. Immunol.172:4285-4291.
8. Weber M et al.(2004) Minor histocompatibility antigens on canine hemopoietic progenitor cells.J. Immunol.170:5861-5868.
9. Metwali A et al.(2004) Cutting Edge: Hemokinin has Substance P-like function and expression in inflammation.J. Immunol.172: 6528-6532.
10. Tajima F et al.(2000) CD34 expression by murine hematopoietic stem cells mobilized by granulocyte colony-stimulating factor.Blood 96: 1989-1993.
11. El-Sukkari D et al.(2003) The protease inhibitor Cystatin C is differentially expressed among dendritic cell populations, but does not control antigen presentation.J. Immunol.171:5003-5011.
12. Foussat A et al.(2003) A comparative study between T Regulatory Type I and CD4⁺CD25⁺ T cells in the control of inflammation.J. Immunol.171: 5018-5026.
13. Joffre O et al.(2004) Induction of antigen-specific tolerance to bone marrow allografts with CD4⁺CD25⁺  lymphocytes.Blood.103: 4216-4221.
14. Hausl C et al.(2004) Preventing restimulation of memory B cells in hemophilia A: a potential new strategy for the treatment of antibody-dependent immune disorders.Blood.104: 115-122.