哺乳动物细胞中的组成型蛋白表达

pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA 表达试剂盒可提供用时5分钟的高效一步克隆策略（"TOPO® 克隆"），用于将 Taq 聚合酶扩增的 PCR 产物直接插入到质粒载体中。无需使用连接酶、PCR 后程序或含有特异性序列的 PCR 引物。经过克隆、分析和转染后，PCR 产物即可在哺乳动物细胞系中直接表达。
 
工作原理

所提供的质粒载体 (pcDNA3.1/V5-His-TOPO®) 经以下物质线性化：

• 适用于 TA Cloning® 的单一 3´ 胸苷 (T) 突出末端
• 共价结合到该载体的拓扑异构酶（该载体被称为“活化”载体）

Taq 聚合酶具有非模板依赖性末端转移酶活性，可在 PCR 产物的 3´ 端添加一个脱氧腺苷 (A)。该试剂盒中提供的线性化载体具有单个突出的 3´ 脱氧胸苷 (T) 残基。这使得 PCR 插入片段高效地与载体连接。
来源于牛痘病毒的拓扑异构酶 I 可以结合到双链 DNA 的特定位点上，并可在一条链上于 5'-CCCTT 序列后切割磷酸二酯链（Shuman，1991）。断裂的磷酸二酯链所释放的能量可通过链切口处的 3' 磷酸基团与拓扑异构酶 I 的酪氨酸残基 (Tyr-274) 形成的共价键而保存。在 DNA 与酶之间形成的该磷酸-酪氨酸键随后又会受到最初链切口处 5' 羟基的攻击，逆转反应并释放拓扑异构酶（Shuman，1994）。TOPO® 克隆利用该反应高效克隆 PCR 产物（参见下文）。






将 PCR 产物被克隆到 pcDNA3.1/V5-His-TOPO® 上且分析得出­转化体的 PCR 产物方向正确后，将该质粒转染至哺乳动物细胞中进行表达。PCR 产物可能以与 V5 表位和多聚组氨酸标签融合形式表达，以便后续检测和纯化；或者通过设计带有一个终止密码子的 3´ PCR 引物，以天然蛋白形式表达 PCR 产物。

运输及储存

pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA 表达试剂盒于干冰上运输。每个试剂盒中装有一盒 pcDNA3.1/V5-His TOPO TA Cloning® 试剂（盒1）和一盒 One Shot® TOP10 化学感受态细胞（盒2）。盒1在 -20°C 下储存，盒2在 -80°C 下储存。
 
试剂盒类型

pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA 表达试剂盒的订购信息如下： 
 
TOPO TA Cloning® 试剂
pcDNA3.1/V5-His TOPO TA Clonin® 试剂（盒1）如下所示。请注意，用户必须自行准备 Taq 聚合酶。
盒1在 -20°C 下储存。

One Shot® 试剂

下表列出了 One Shot® 化学感受态细胞试剂盒中所包含的商品。在 -80°C 下储存。

测序引物

下表列出了 T7 测序引物和 BGH 反向测序引物的序列和皮摩尔量。

TOP10 细胞的基因型
 
TOP10：该菌株用于常规克隆。请注意，该菌株不能用于 DNA 单链补救。
F- mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) F80lacZDM15 DlacC74 recA1 araD139 D(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

以下流程图概述了克隆和表达您的 PCR 产物所需的实验步骤。

设计您的 PCR 引物

设计用于克隆您目标 DNA 序列的 PCR 引物对于表达至关重要。PCR 引物是不含 ATG 起始密码子的 C 端融合载体。如果待扩增的 DNA 中没有 ATG 起始密码子或最佳的翻译起始序列（Kozak 序列），则需要将这些特征整合至您的正向引物中。
 
示例：                Kozak 共有序列为 (G/A) NNATGG
 
根据 PCR 产物的不同性质，您可考虑以下两种选择：

• 在 V5 表位和多聚组氨酸标签（C 端肽）框架内进行克隆，以便对 PCR 产物进行检测和/或纯化。

或

• 纳入天然终止密码子从而表达天然蛋白。

备注：  克隆效率可能因 5´ 引物核苷酸序列而异。

根据下图设计您的 PCR 引物。
 
请勿向您的 PCR 引物中添加 5´ 磷酸基团。因为以此合成的 PCR 产物将不会连接到 pcDNA3.1/V5-His-TOPO® 上。
 
TOPO TA Cloning® 位点

对限制性酶切位点进行了标记，以指示实际切割位点。所提供的载体在953和954碱基对之间进行线性化。这即是 TOPO® 克隆位点。请注意，如需 pcDNA3.1/V5-His-TOPO® 的完整序列，可从我们的网站下载或联系技术服务部门。

介绍

确定 PCR 策略并合成引物后，您即可着手生成 PCR 产物。
 
需由用户自行准备的材料

您需要准备以下试剂和设备。

• Taq 聚合酶
• 热循环仪
• 用于生成 PCR 产物的 DNA 模板和引物

 
聚合酶混合物

如果您想使用含 Taq 聚合酶和校正聚合酶的混合物，所用 Taq 的比例必须大于 10:1，以确保 PCR 产物上出现 3´ A-突出末端（如 Expand™ 或 eLONGase™）。
 
如果您所使用的聚合酶混合物中没有足量的 Taq 聚合酶或仅使用了校正聚合酶，您可以自行添加 3' A-突出末端。
 
生成 PCR 产物

1. 设置下述 50 μL PCR 反应条件。如果您使用质粒 DNA 作为模板，则需要较少 DNA，如果您使用基因组 DNA 作为模板，则需要较多 DNA。为您的引物和模板选择合适的循环参数。确保在最后一次循环结束后，于 72℃ 下延伸 7-30 分钟，以确保所有 PCR 产物均延伸完全并进行 3´ 腺苷酸化。 



DNA 模板	10-100 ng
10X PCR 缓冲液	5 µL
50 mM dNTP	0.5 µL
引物	各 100-200 ng
无菌水	定容至最终体积 49 µL
Taq 聚合酶（1单位/μL）	1 µL
总体积	50 µL




2. 通过琼脂糖凝胶电泳检查 PCR 产物。您应会看到一条单一离散条带。如果没有看到一条单一条带，请参阅下文备注。

如果在 PCR 后未获得一条单一离散条带，则在使用 pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA 表达试剂盒之前，您可以对片段进行凝胶纯化（见第16页）。需特别注意避免核酸酶污染源污染和长时间暴露于紫外光下。或者，您还可以优化 PCR 反应条件以消除多条带和弥散现象（Innis 等人，1990）。我们的 PCR Optimizer™ 试剂盒（货号 K1220-01）可帮助您优化 PCR 反应条件。

介绍

利用 TOPO® 克隆技术，您可在一天内生成 PCR 产物并将其连接到 pcDNA3.1/V5-His-TOPO® 上以及将重组载体转化至 TOP10 大肠杆菌中。请务必将一切所需物品准备妥当，使其处于随时可用状态，以确保您可获得最佳结果。如果您是第一次使用 TOPO® 进行克隆，请伴随您的样本平行进行对照反应。
 
我们的最新实验结果表明，在 TOPO® 克隆反应中加入盐（200 mM NaCl 和 10 mM MgCl₂）可将转化体的数量提升 2-3 倍。我们还发现，加入盐后，孵育5分钟以上也会增加转化体的数量。与之相比，在未加入盐的早期实验中，孵育时间超过5分钟时，转化体数量随之下降。
 
加入盐可延长孵育时间，这是因为拓扑异构酶 I 在连接 PCR 产物并从 DNA 上分离后，可能会重新结合并切割 DNA，而盐可以阻止拓扑异构酶 I 重新结合。因此会得到更多的完整分子，从而提高转化效率。
 
所以，我们建议在 TOPO® 克隆反应中加入盐。为此，我们在试剂盒中提供了盐储备液。请注意，TOPO® 克隆反应中所添加的盐量取决于您要化学转化感受态细胞（已提供）还是电转化感受态细胞（参见下文）。为此，我们为您提供了两种不同的 TOPO® 克隆反应，以帮助您获得最佳实验结果。请仔细阅读以下信息。

 
化学感受态大肠杆菌

对于 TOPO® 克隆并转化入化学感受态大肠杆菌而言，在 TOPO® 克隆反应中加入氯化钠和氯化镁（终浓度为 200 mM NaCl 和 10 mM MgCl₂）可随着时间延长增加菌落数。我们提供了一份盐溶液（含 1.2 M NaCl 和 0.06 M MgCl₂），以将 TOPO® 克隆反应中 NaCl 和 MgCl₂ 的浓度调节至推荐浓度。
 
电转感受态大肠杆菌

对于 TOPO® 克隆并转化入电转感受态大肠杆菌而言，同样必须在 TOPO® 克隆反应中加入盐，但盐量必须下调至 50 mM NaCl 和 2.5 mM MgCl₂，以避免电弧产生。将该盐溶液稀释4倍，制成含 300 mM NaCl 和 15 mM MgCl₂ 的溶液，以便添加至 TOPO® 克隆反应中。
 
需由用户自行准备的材料

除常规的微生物用品（即平板、涂布器）外，您还需要准备以下试剂和设备。

• 42℃ 水浴（或带比色皿的电穿孔仪，可选）
• 含 50-100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板（每次转化用两个平板）
• 琼脂糖凝胶电泳所用的试剂和设备
• 37℃ 振荡培养箱和非振荡培养箱

不通过蓝白斑筛选查看是否存在插入片段。需通过限制性内切酶分析或测序法来分析单个重组质粒，以确定是否有插入片段及其方向。该试剂盒中的测序引物可用于对多克隆位点中的插入片段序列进行测序，以确认方向和阅读框。
 
转化准备

每次转化时，您需要准备一小瓶感受态细胞和两个选择性平板。
 

• 在 42℃ 水浴中平衡（以便进行化学转化），或如果使用电转感受态大肠杆菌，则设置电穿孔仪。
• 对于电穿孔，取少量盐溶液进行4倍稀释（例如取 5 μL 盐溶液加入 15 μL 无菌水中），制得稀释盐溶液。
• 将盒2中含有 SOC 培养基的小瓶加热至室温。
• 在 37℃ 下加热选择性平板30分钟。
• 每次转化时，将一小瓶 One Shot® 细胞置于冰上解冻。

 
设置 TOPO® 克隆反应条件

下表列出了 TOPO® 克隆反应 (6 µL) 的设置条件，旨在最终转化入 One Shot® TOP10 化学感受态大肠杆菌（已提供）或电转感受态大肠杆菌。
 
备注：  TOPO® 载体溶液的颜色呈红色或黄色，这是正常现象，用于溶液显像。

*制备完成后将所有试剂储存在 -20℃ 下。盐溶液和水可在室温或 +4℃ 下储存。
 
进行 TOPO® 克隆反应

1. 轻柔混合反应体系并在室温 (22-23℃) 下孵育5分钟。备注：在多数应用下，5分钟即会产生大量菌落用于分析。根据您的需求，TOPO® 克隆反应的时间可设置在30秒至30分钟的范围内。对于 PCR 产物的常规亚克隆操作，30秒可能足够。如果 PCR 产物较大 (> 1 kb) 或者您要用 TOPO® 克隆一组 PCR 产物，适当延长反应时间将获得更多菌落。


2. 将反应体系置于冰上，之后进行 One Shot® 化学转化或电穿孔转化。备注：您可将 TOPO® 克隆反应体系置于 -20℃ 下储存过夜。

 
One Shot® TOP10 化学转化

1. 将上述步骤2得到的 2 µL TOPO® 克隆反应体系加到一小瓶 One Shot® TOP10 化学感受态大肠杆菌中，轻柔混合。请勿通过上下吹吸混合。


2. 在冰上孵育 5-30 分钟。备注：延长冰上孵育时间对转化效率的影响微乎其微。孵育时长可由用户自行决定。


3. 在 42℃ 下热激细胞30秒，请勿振荡。


4. 立即将试管转移至冰上。


5. 加入 250 µL 室温 SOC 培养基。


6. 盖紧试管并在 37℃ 下水平振荡试管 (200 rpm) 1小时。


7. 在预热的选择性平板上涂布 25-200 µL 各转化混合物，并在 37℃ 下过夜孵育。建议您在两个平板上涂布不同量的转化混合物，以确保至少一个平板上会形成分布良好的菌落。


8. 一次有效的 TOPO® 克隆反应可产生数百个菌落。选取约10个菌落进行分析（参见“阳性克隆分析”）。

 
电穿孔转化

1.  将 2 µL TOPO® 克隆反应体系加入含 50 µL 电转感受态大肠杆菌的 0.1 cm 比色皿中，轻柔混合。请勿通过上下吹吸混合。避免形成气泡。


2.  按照您自己的实验方案，用您的电穿孔仪对样本进行电穿孔。备注：  如果在转化时出现电弧，请参见下文。


3. 立即加入 250 µL 室温 SOC 培养基。


4. 将溶液转移至 15 mL 弹扣盖试管（如 Falcon 试管）中，在 37℃ 下振荡至少1小时，促进抗生素抗性基因的表达。


5. 在预热的选择性平板上涂布 10-50 µL 各转化混合物，并在 37℃ 下过夜孵育。为确保少量转化混合物的均匀涂布，添加 20 μl 的 SOC 培养基。建议您在两个平板上涂布不同量的转化混合物，以确保至少一个平板上会形成分布良好的菌落。


6. 一次有效的 TOPO® 克隆反应可产生数百个菌落。选取约10个菌落进行分析（参见“阳性克隆分析”）。

 
在 TOPO® 克隆反应体系中加入稀释盐溶液使 TOPO® 克隆反应中的 NaCl 和 MgCl₂ 终浓度分别达到 50 mM 和 2.5 mM。为避免在电穿孔期间样本产生电弧，细胞体积应介于 50-80 µL（0.1 cm 比色皿）或 100-200 µL（0.2 cm 比色皿）之间。

如果在转化过程中出现电弧，建议采取以下措施：

• 将电穿孔仪正常充电所用电压降低 10%。
• 通过将负载电阻减小至100欧姆，缩短脉冲长度。
• 在电穿孔前，用乙醇沉淀 TOPO® 克隆反应体系，再重悬于水中。

 
阳性克隆分析

1. 选取10个菌落，接种于含 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基 (3-5 mL) 中过夜培养。


2. 使用您所选的方法分离质粒 DNA。如果您需要超纯质粒 DNA 进行自动测序或手动测序，建议您使用 S.N.A.P.™ 小提试剂盒（货号 K1900-01）。


3. 请注意，PCR 产物将双向克隆。通过限制性内切酶分析或测序法分析质粒中的插入片段及其方向。试剂盒中提供了 T7 和 BGH 反向测序引物，帮助您对插入片段进行测序。

关于 TOPO Cloning® 位点周围的限制性酶切位点和序列，请参阅示意图。如需载体的完整序列，请访问我们的网站或联系技术服务部门。
如果您需要了解如何设置限制性内切酶消化或 DNA 测序，请参阅通用分子生物学教材（Ausubel 等人，1994；Sambrook 等人，1989）。
 
备选分析方法

您可能希望使用 PCR 直接分析阳性转化体。将 T7 或 BGH 反向测序引物与在插入片段内结合的引物联合用作 PCR 引物。您需要确定扩增条件。如果您是第一次使用该技术，我们建议您平行进行限制性内切酶分析，以确保获得正确的 PCR 实验结果。由于错误引发或模板污染，可能会产生伪影。

为方便您使用，提供了以下实验方案。也可以使用适宜的其他方案。

1. 制备由 PCR 缓冲液、dNTP、引物和 Taq 聚合酶组成的 PCR 混合物。使用 20 μL 反应体积。乘以待分析的菌落数（如10）。


2. 选取10个菌落并分别将其重悬于 20 μL PCR 混合物中。（请务必制作菌斑平板来保存菌落以便进一步分析。）


3. 在 94℃ 下孵育反应体系10分钟以裂解细胞并使核酸酶失活。


4. 使用此前已确定的参数扩增 20-30 个循环（参见上文）。


5. 在 72℃ 下孵育10分钟，进行最终延伸。在 +4℃ 下储存。


6. 通过琼脂糖凝胶电泳进行显像。

 
如果您在获取转化体或正确插入片段时遇到问题，请进行对照反应。这将帮助您解决实验中遇到的疑难问题。
 
长期储存

鉴别正确克隆后，请确保分离出单个菌落并制备甘油储备液，以供长期储存。我们建议您将质粒 DNA 储备液储存于 -20℃ 下。

1. 在含有 50-100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上划线接种初始菌落。


2. 分离一个单一菌落，接种至 1-2 mL 含有 50-100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中。让其生长，直至培养物达到静止期。


3. 取 0.85 mL 培养物与 0.15 mL 无菌甘油混合，然后转移至冻存管中。


4. 在 -80℃ 下储存。

• TOPO® 克隆反应体系仅孵育30秒而非5分钟。
• 您获得的菌落数可能不是最多，但由于 TOPO® 克隆具有高克隆效率，大部分转化体都会含有插入片段。
• 向化学感受态细胞中加入 2µl TOPO® 克隆反应体系后，仅需要在冰上孵育5分钟。
• 将孵育时间延长至30分钟并不会显著提高转化效率。

• 对于含盐的 TOPO® 克隆反应体系，孵育时间为 20-30 分钟，而不是5分钟。
• 延长含盐的 TOPO® 克隆反应体系的孵育时间，可使更多分子连接，从而提高转化效率。加入盐似乎能够阻止拓扑异构酶在与 PCR 产物连接并与 DNA 分离后重新结合并切割 DNA。 

• 增加 PCR 产物用量
• 将 TOPO® 克隆反应体系的孵育时间设定为 20-30 分钟
• 浓缩 PCR 产物   

介绍

获得所需的构建体后，您即可将质粒转染进所选的哺乳动物细胞中。请阅读以下转染指南。该试剂盒中含有表达对照载体 (pcDNA3.1/V5-His-TOPO/lacZ©)，您可以使用该载体来检查特定细胞系的转染效率和表达情况。
 
质粒制备

用于转染真核细胞的质粒 DNA 必须非常纯净，不含苯酚和氯化钠。污染物会杀死细胞，而盐会干扰脂质，从而降低转染效率。我们建议使用 S.N.A.P.™ MidiPrep 试剂盒（货号 K1910-01）或通过 CsCl 梯度离心法来分离质粒 DNA（最多 200 µg）。
 
转染方法

对于已建立的细胞系（如 HeLa），请查阅原始参考文献或咨询您的细胞系供应商，以了解最佳转染方法。我们建议您严格遵循针对您的细胞系所制定的方案。应特别注意培养基要求，何时进行细胞传代，以及分流细胞所用的稀释比例。更多信息见《现行分子生物学方案》（Ausubel 等人，1994）。
 
转染方法包括磷酸钙法（Chen 和 Okayama，1987；Wigler 等人，1977）、脂质体介导法（Felgner 等人，1989；Felgner 和 Ringold，1989）和电穿孔转染法（Chu 等人，1987；Shigekawa 和 Dower，1988）。我们提供磷酸钙转染试剂盒（货号 K2780-01）和各种转染试剂以供选择。有关可用试剂的更多信息，请访问我们的网站 或致电技术服务部门。
 
阳性对照

我们提供了 pcDNA3.1/V5-His-TOPO/lacZ© 作为哺乳动物细胞转染和表达的阳性对照载体。其可用于优化您的细胞系的转染条件。在 CMV 启动子的控制下由哺乳动物细胞表达编码 b-半乳糖苷酶的基因。成功转染后会发生 β-半乳糖苷酶表达，这可被轻松检测到（见下文）。
 
β-半乳糖苷酶活性测定

通过使用不含细胞的裂解物进行活性测定（Miller，1972）或采用细胞染色法进行活性测定，您可测定β-半乳糖苷酶的表达。我们提供 b-Gal 检测试剂盒（货号 K1455-01）以及 b-Gal 染色试剂盒（货号 K1465-01）以便快速、轻松地检测 b-半乳糖苷酶表达。 

介绍

您可在瞬时转染细胞或稳定细胞系中进行 PCR 产物表达。您可以使用功能测定法来检测由您的 PCR 产物编码的蛋白，或者如果您拥有抗蛋白抗体，也可以进行蛋白质印迹分析。如果您选择以与 V5 表位和多聚组氨酸标签融合形式表达您的 PCR 产物，您可以使用针对 V5 表位或多聚组氨酸 C 端的抗体来检测融合蛋白。根据您的需要，可使用金属离子色谱法对融合蛋白进行纯化（见下文）。
 
检测融合蛋白

为通过蛋白质印迹法检测融合蛋白，您需要使用转染后的细胞制备细胞裂解液。我们建议您设定一个时间段来优化融合蛋白的表达（如，转染后24、48、72小时等）。
 
含有 V5 表位和多聚组氨酸区的 C 端肽将使您的蛋白增加约 5 kDa。
 
检测用抗体

我们提供多种抗体用于检测源于 pcDNA3.1/V5-His-TOPO© 的融合蛋白表达情况。下表列出了可供使用的抗体和订购信息。供应量足够进行25次蛋白质印迹分析。 

制备细胞以供纯化

在 ProBond™ 上对蛋白质进行纯化前，请按照以下步骤制备细胞以供裂解。您需要 5 x 10⁶ 至 1 x 10⁷ 个细胞用于在 2 mL ProBond™ 纯化柱中纯化蛋白质（参见 ProBond™ 纯化系统手册）。

1. 将细胞接种至5个 T-75 培养瓶或 2-3 个 T-175 培养瓶中。


2. 在选择性培养基中培养细胞，直至细胞生长至汇合度达到 80-90%。


3. 收获细胞，方法如下：利用胰蛋白酶-EDTA 处理细胞 2-5 分钟，或者刮取细胞置于 PBS 中。


4. 用新鲜培养基稀释（如有必要）使胰蛋白酶失活，并将细胞转移至无菌微量离心管中。


5. 以 1500 rpm 离心细胞5分钟。可立即裂解细胞或液氮冷冻并储存于 -80℃ 下备用。备注：关于细胞裂解chegnxu ，如果您使用 ProBond™，请参阅 ProBond™ 纯化系统手册。如果您使用不同的树脂，请参阅生产商的说明。

介绍

如果您想要构建稳定的细胞系，可通过 Geneticin® 选择性抗生素筛选细胞集落。为方便您使用，下文介绍了基本信息和使用指南。
 
Geneticin® 选择性抗生素

Geneticin® 选择性抗生素可通过干扰核糖体功能而阻断哺乳动物细胞中的蛋白质合成。它是一种氨基糖苷类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素和卡那霉素类似。源自 Tn5 的细菌氨基糖苷磷酸转移酶 (APH) 基因在哺乳动物细胞中表达，导致对 Geneticin® 脱毒（Southern 和 Berg，1982）。
 
Geneticin® 筛选指南

Geneticin® 选择性抗生素可从赛默飞世尔科技购得（货号 11811-031）。用法如下：

1. 在缓冲液（如 100 mM HEPES，pH 值7.3）中制备 Geneticin®。


2. 在完全培养基中使用的 Geneticin® 浓度为 100-1000 μg/mL。


3. 根据活性药物含量计算浓度。


4. 在细胞系中检测各种 Geneticin® 浓度，确定足以杀死细胞的浓度（杀灭曲线）。细胞对 Geneticin® 的敏感性不同。

存在致死剂量的 Geneticin® 时，细胞仍会分裂一次或两次，因此药物作用要在数天后才会变得明显。完成完全筛选可能需要在选择性培养基中生长 2-4 周。

介绍

您可在瞬时转染细胞或稳定细胞系中表达目标基因。您可以使用功能测定法或蛋白质印迹分析来检测重组蛋白（见下文）。
 
制备细胞裂解液

为通过蛋白质印迹法检测融合蛋白，您需要使用转染后的细胞制备细胞裂解液。下文提供了实验方案示例。也可以使用适宜的其他方案。为裂解细胞：

1. 用磷酸盐缓冲盐水洗涤单层细胞（约 5 x 10⁵ 至 1 x 10⁶ 个细胞）一次。


2. 将细胞刮入 1 mL PBS 中，在 1500 x g 下离心5分钟以沉淀细胞。


3. 重悬于 50 µL 细胞裂解缓冲液中。也可以使用其他适合的细胞裂解缓冲液。涡旋。


4. 在 37℃ 下孵育细胞悬液10分钟以裂解细胞。备注：如果蛋白质可能发生降解，您可以选择在室温或冰上裂解细胞。


5. 在 +4℃ 下以 10,000 x g 离心细胞裂解液10分钟，使细胞核沉淀并将上清液转移到新试管中。测定裂解液中的蛋白质浓度。备注：请勿使用考马斯亮蓝或其他染料进行蛋白质含量测定。NP-40 会干扰染料与蛋白结合。


6. 添加 SDS-PAGE 上样缓冲液至终浓度为 1X，将样本煮沸5分钟。


7. 将 20 µg 裂解物上样至 SDS-PAGE 凝胶上，开始电泳。使用适当比例的丙烯酰胺来分离融合蛋白。

 
聚丙烯酰胺凝胶电泳

我们提供了多种预制的 NuPAGE® 和 Novex® Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶及电泳装置，以便通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离重组融合蛋白并显像。我们还提供大量蛋白分子量标准品和染色试剂盒供您选择。有关重组蛋白显像所需的适用凝胶、标准品和染色剂的更多信息，请访问我们的网站或联系技术服务部门。
 
检测融合蛋白

您可以使用我们的抗 V5 抗体、抗 His（C 端）抗体或目标蛋白抗体，通过蛋白质印迹分析检测重组融合蛋白的表达情况。此外，我们可提供 Positope™ 对照蛋白质（货号 R900-50）作为阳性对照，用于检测含有 V5 表位或多聚组氨酸 (6xHis) 标签的融合蛋白。我们还提供即用型 WesternBreeze® 显色试剂盒和 WesternBreeze® 化学发光试剂盒，以便通过比色法或化学发光法检测抗体。有关更多信息，请访问我们的网站或致电技术服务部门。
 
含有 V5 表位和多聚组氨酸区的 C 端肽将使您的蛋白增加约 3.6 kDa。
 
β-半乳糖苷酶活性测定

如果您使用对照表达质粒，您可以使用不含细胞的裂解物，通过蛋白质印迹分析或活性测定法来检测 β-半乳糖苷酶的表达情况（Miller，1972）。我们提供 β-半乳糖苷酶抗血清、β-半乳糖苷酶检测试剂盒和 β-半乳糖苷酶染色试剂盒，用于快速、轻松地检测 β-半乳糖苷酶的表达情况。 

pcDNA3.1/V5-His© TOPO® TA 克隆对照反应
 
介绍

我们建议您在首次使用试剂盒时进行以下 TOPO® 克隆对照反应，以帮助您评估实验结果。使用试剂盒中的试剂进行对照反应，可得到包含 lac 启动子和编码 LacZa 蛋白的对照 PCR 产物。成功完成对照 PCR 产物的 TOPO® 克隆后，会在含有氨苄青霉素和 X-gal 的 LB 琼脂平板上生成蓝色菌落。
 
实验开始前

在进行对照反应前，请确保已准备以下试剂：

• 含 40 mg/mL X-gal 的二甲基甲酰胺溶液
• 含 50-100 µg/mL 氨苄青霉素和 X-gal 的 LB 平板（每次转化用两个平板）
• 如需将 X-gal 加到之前制备好的琼脂平板中，将平板预热至 37°C。用移液器将 40 µl 的 40 mg/mL 储备液加至平板上，均匀涂布并静置待其干燥15分钟。避光放置平板。

 
生成对照 PCR 产物

1. 要生成含有 lac 启动子和 LacZa 的 500 bp 对照 PCR 产物，制备 50 µl PCR 反应体系，如下所示：

对照 DNA 模板 (50 ng)                        1 µl
10X PCR 缓冲液                                               5 µl
50 mM dNTP                                          0.5 µl
对照 PCR 引物（µµ各 0.1 g/l）              2 µl
无菌水                                                  40.5 µl       
Taq 聚合酶（1单位/µl）                                  1  µl
总体积                                                      50 µl



2. 用 70 µl（1 滴）矿物油覆盖。


3. 设置以下循环参数进行扩增：
   
   

   步骤			时间	温度	循环
   预变性			2分钟	94°C	1X
   变性			1分钟	94°C
   退火			1分钟	60°C	25X
   延伸			1分钟	72°C
   最终延伸			7分钟	72°C	1X

   
    


4. 从反应中取 10 µl，通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。应可见一条离散的 500 bp 条带。进行对照 TOPO® 克隆反应。

对照 TOPO® 克隆反应

使用生成的对照 PCR 产物和 pcDNA3.1/V5-His-TOPO© 载体，制备两个 6 µl TOPO® 克隆反应体系，如下所述。

1. 制备对照 TOPO® 克隆反应体系：



试剂			"仅载体"	"载体 + PCR 插入片段"
无菌水			4 µl	3 µl
盐溶液或稀释盐溶液			1 µL	1 µL
对照 PCR 产物			--	1 µl
pcDNA3.1/V5-His-TOPO © 载体			1 µl	1 µl


  
2. 取各反应体系 2 µl，分别加入一小瓶 One Shot® TOP10 细胞中。


3. 在含有 50-100 µg/mL 氨苄青霉素和 X-gal 的 LB 平板上涂布 10-50 µl 各转化混合物。确保在两个平板上涂布不同量的转化混合物，以确保至少一个平板上会形成分布良好的菌落。在平板上涂布少量转化混合物时，添加 20 µl SOC，以便涂布均匀。


4. 在 37°C 下过夜孵育。

结果分析

通过载体 + PCR 插入片段反应，应生成数百个菌落。90% 以上菌落呈蓝色，并含有 500 bp 插入片段。
 
转化对照

试剂盒中包括 pUC19 质粒，以检查 One Shot® TOP10 感受态细胞的转化效率。使用该实验方案，用 10 pg 的 pUC19 转化一小瓶 One Shot® TOP10 细胞。在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上涂布 10 µl 转化混合物以及 20 µl SOC。转化效率应约为 1 x 10⁹ cfu/µg DNA。
 
影响克隆效率的因素

请注意，以下变量会导致转化和/或克隆效率降低。大多数变量都可被轻松校正，但如果您要克隆较大插入片段，您可能无法获得预期的 90%（或更高）克隆效率。

室温孵育5分钟，然后置于冰上

• Taq 聚合酶
• 平衡至 72°C 的加热块
• 苯酚-氯仿（可选）
• 3 M 醋酸钠（可选）
• 100% 乙醇（可选）
• 80% 乙醇（可选）
• TE 缓冲液（可选）

1. 在使用 Vent® 或 Pfu  或 Pfx 聚合酶进行扩增后，将试管置于冰上，并在每管中加入 0.7-1 个单位的 Taq 聚合酶。混匀。无需变更缓冲液。


2. 在 72°C 下孵育 8-10 分钟（不循环）。


3. 将试管置于冰上。现在可将 DNA 扩增产物连接到 pcDNA3.1/V5-His-TOPO© 上。

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