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免疫原设计

用于产生抗体的抗原

  • 您可以使用合成肽、重组蛋白、免疫原等。我们不建议使用整个细胞产生抗体。
  • 使用任意选择的抗原肽或使用重组融合蛋白，通过标准方法通常可获得 65%-70% 的成功率。如果使用标准的生物信息学算法选择抗原肽，可将成功率提高到 75%-80%。如果使用 Invitrogen 的专有方法将这种经过优化的肽偶联，则可将成功率提高到约 85%-90%。

最近的一项合作研究表明，在500种单独蛋白靶标中，通过蛋白质印迹分析得出约450种多克隆肽抗体识别出相应靶标。

肽偶联

  • 肽通常由于太短而不具有免疫原性。载体蛋白可增强免疫原性。MAP 和 KLH 是两种最常用的偶联方法。其他可用的偶联物为 OVA（卵白蛋白）、BSA（牛血清白蛋白）和 THY（甲状腺球蛋白）。
  • 通常通过设计到肽中的 Cys 巯基进行偶联。
  • 对于 < 6 kDa 的肽，需要进行偶联。
  • 如果研究的是无脊椎动物种属，您应该使用载体蛋白，如卵白蛋白和 KLH（来自海螺）。KLH 与脊椎动物蛋白无同源性

我们利用专有的多重偶联方法，通过末端和关键内部位点进行肽偶联。该方法以交替、多重构象呈现肽，使其更具抗原性并可产生具有更大效用的抗体用于各种检测。我们的偶联方案在所呈现的肽和肽在天然蛋白中呈现的方式之间实现更佳的表位匹配。

我们提供以下选项用于肽与载体蛋白的偶联：

  • KLH——钥孔血蓝蛋白，这是一种分离自软体动物血淋巴的含铜蛋白。该蛋白以5种不同的聚集状态（在 pH 值为7.4的 Tris 缓冲液中）存在，当 pH 值发生适度变化时容易解离。亚基分子量约为 450 kDa。
  • BSA——牛血清白蛋白，亚基为 67 kDa。该蛋白常用于在免疫检测中阻滞非特异性结合位点。如果未来的检测涉及 BSA（例如作为阻滞剂），则不应将其用作载体。
  • OVA——卵白蛋白，这是一种糖蛋白且是蛋清中的主要蛋白。其 pH 值为4.6，分子量为 45 kDa。
  • MAP——多抗原肽。该系统使用在多个位置与多聚赖氨酸核心相连的肽。可产生含有 2-16 个合成肽分子拷贝的 MAP。MAP 具有较高的肽抗原与核心分子摩尔比，无需使用载体蛋白即可引发抗体反应。

MAP 对比 KLH

  • 在分支赖氨酸或 MAP 载体核心上合成您的肽的8个拷贝。
  • MAP 肽适用于通过直接注射（加佐剂）来产生抗体。
  • 由于肽通过 C 端相连，MAP 技术对 N 端或内部肽有利，不推荐用于源自 C 端尾部的肽。载体连接也可能引起一定程度的空间位阻。C 端肽使用 KLH 偶联物。
  • 平均肽长约为15个残基。
  • MAP 肽的行为与大分子蛋白很相似。
  • MAP 肽因其结构而可能具有略高的滴度。无关抗体可附着在肽分支上。

插入片段-标签不兼容

许多融合载体可提供 N 端或 C 端表位标签，便于重组肽的纯化和检测。表位融合可减少纯化重组蛋白所需的步骤数，然而，这些标签也可能干扰重组肽的结构和功能。由于不能预测这些肽融合体的折叠情况，因此无法预测表位标签的影响。在极少数情况下，由于表位标签与掩盖抗原氨基酸的融合多肽相互作用，普通分子检测方法无法检测到表位标签。

Tag-On-Demand™ 方法使用基于腺病毒的终止抑制技术，可在哺乳动物细胞中由单一表达载体表达未标记（即天然）或 C 端标记的目标重组蛋白。使用单一克隆，您可以生成标记的蛋白用于验证表达，也可以生成未标记的蛋白用于验证功能。您可以使用其中一个 Tag-On-Demand™ Gateway® 载体或 Invitrogen 提供的其他兼容表达载体。

如果您想以与 C 端标签融合形式表达您的基因，则必须在含标签的框内进行克隆。

肽设计

为成功产生抗体，在选择蛋白序列的合适部分时，需要考虑许多重要因素。肽的序列、氨基酸组成和长度将影响正确组装、纯化和随后的溶解是否可行。

肽长度和纯度

粗肽的纯度通常随着长度的增加而降低。当纯度 >70% 时，足以用于产生或检测抗体。然而，对于生物活性研究，通常需要大于 95% 的纯度。通常使用长度为 10-15 个残基的肽孵育抗血清，且序列小于15个残基的肽的产率通常足够。

不同合成规模的典型产率

规模产率（粗品）产率（纯化）
2020 mg10-12 mg
5050 mg20-25 mg
100100 mg50-51 mg


组成

溶解度受到组成的强烈影响。对于含有很大比例疏水性残基（如 Leu、Val、Ile、Met、Phe 和 Trp）的肽，在水溶液中的溶解度往往有限且可能完全不溶。为确保获得良好的溶解度，疏水性氨基酸含量应低于 50%，并且每5个氨基酸中应至少有一个带电残基（如 Asp、Glu、Lys 和 Arg）。

Cys、Met 或 Trp 残基在合成中通常存在问题，因为这些残基容易发生氧化和/或副反应。如果可能，选择此类残基含量最少的序列。或者，可以对一些残基进行保守替换。

复溶/溶解度

肽的溶解度取决于肽的氨基酸含量。将肽全部溶解之前，取少量肽用于检测在水、PBS 或各种溶剂中的溶解度。对于大多数肽，可使用 PBS 或 PBS-叠氮化物溶解。根据氨基酸含量，可能需要使用温和的酸或碱（如氨水或醋酸）。如果肽不溶于水，请采用以下建议之一：

  • 对于呈酸性（由于存在天冬氨酸和/或谷氨酸残基）的肽，加入少量 5% 氢氧化铵。
  • 对于呈碱性（由于存在组氨酸、赖氨酸和/或精氨酸残基）的肽，加入少量 5% 醋酸。在复溶含有半胱氨酸的肽时，应避免使用碱性条件。
  • 对于疏水性肽（由于存在异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和/或缬氨酸残基），将肽溶解在极少量乙腈、异丙醇、乙醇、DMF 或 DMSO 中，另添加 PBS 或直接使用这些溶剂替代 PBS。

储存

  • 大多数肽在 -20℃ 下可以一直保持稳定，以冻干形式储存在干燥器中时尤其如此。
  • 将冻干肽暴露于空气前，应先使其恢复至室温。这将最大限度地减少水分相关影响。当无法进行冻干处理时，另一个最佳储存方法是将肽以较小的工作规格等分试样形式储存在 -20℃ 或 -80℃ 下。

翻译后修饰

高等真核生物可进行多种翻译后修饰，包括甲基化、硫酸化、磷酸化、脂质加成和糖基化。这类修饰可能对所表达蛋白的功能至关重要。分泌蛋白、膜蛋白和靶向囊泡或某些细胞器的蛋白可能被糖基化。最常见且研究最多的是 N-连接糖基化，此过程会将寡糖独特地添加到蛋白质中 Asn-X-Ser/Thr 识别序列的天冬酰胺上。另一种糖基化类型是 O-连接糖基化，涉及简单的寡糖链或糖胺聚糖链 (1)。当在异源表达系统中表达和纯化糖基化蛋白时，可能需要快速确定该蛋白是否正确糖基化。已发表的蛋白质糖类分析方案可供分子生物学家用于表征目标糖基化蛋白 (2)。以下部分讨论了在真核细胞中发现的糖基化模式。

哺乳动物细胞中的糖基化

N-连接糖蛋白含有标准的分支结构，由甘露糖 (Man)、半乳糖、N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc) 和神经氨酸组成。O-连接糖蛋白由多种糖组成，包括半乳糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺和神经氨酸。

昆虫细胞中的糖基化

昆虫细胞（Sf21、Sf9、High Five™）中 N-连接糖基化的性质取决于所表达的蛋白和宿主细胞系。N-连接糖基化通常为高甘露糖型。O-连接糖基化与哺乳动物细胞相似，但不完全相同，具体取决于蛋白的定位和类型。果蝇 N-连接糖基化没有经过修剪和唾液酸化，复杂性较低。因此，果蝇蛋白具有较高的甘露糖含量。果蝇还可以添加 O-连接糖基化。Mimic™ Sf9 昆虫细胞是经修饰的 Sf9 细胞，可稳定表达多种哺乳动物糖基转移酶。利用这些酶，可由昆虫细胞生产末端唾液酸化的双触角 N-聚糖。该细胞可用于在杆状病毒和稳定的昆虫表达系统中生产更多的哺乳动物样蛋白。

酵母中的糖基化

酿酒酵母 N-连接糖蛋白仅含有高度分支和延伸的高甘露糖结构（高糖基化）。酿酒酵母 O-连接糖蛋白由少于4个的甘露糖残基组成。毕赤酵母 N-连接糖基化主要由短链 Man (3) GlcNAc 残基组成，更接近典型的哺乳动物高甘露糖糖基化模式。存在毕赤酵母 O-连接寡糖，但不是毕赤酵母总可溶性糖蛋白的主要组分。以下内容包括：两种基本类型的 N-连接糖基化概述 (1,2)、可在体内使用的糖基化抑制剂列表 (2) 以及可用于分析蛋白质糖类结构的酶列表。有关真核生物中糖基化的更多信息，请参见参考文献4。

特定抗生素对真核生物糖基化结构的影响 (2)

抑制剂类型靶酶 对寡糖结构的影响对 SDS-PAGE 电泳迁移率的影响
衣霉素GlcNAc 转移酶
  • 阻止核心寡糖的第一个合成步骤
  • Asn 残基不发生糖基化
蛋白质迁移更快，异质性更小
脱氧野尻霉素 粟精胺葡糖苷酶 I 和/或 II
  • 阻止去除第一个葡萄糖残基，从而抑制进一步加工
  • 对内切糖苷酶 H (Endo H) 消化敏感
取决于加工 蛋白大小似乎偏小
脱氧甘露糖野尻霉素α-甘露糖苷酶 I
  • 阻止去除高甘露糖结构 αI-3 臂上的甘露糖残基
  • 阻滞 GlcNac T II 的活性（α1-6 臂无修饰）
  • 对 Endo H 敏感
蛋白大小似乎偏小
苦马豆素α-甘露糖苷酶 II
  • 阻止去除高甘露糖结构 α1-6 臂上的甘露糖残基
  • 阻滞 GlcNac T II 的活性（α1-6 臂无修饰）
  • 可能在 α1-3 臂上添加 GlcNAc、Gal 和 NeuAc
  • 对 Endo H 敏感
取决于加工的程度

用于分析糖蛋白的酶

酶酶类型特异性参考文献
内切糖苷酶 DEndo切割各种高甘露糖聚糖
 7, 11
内切糖苷酶 FEndo切割各种高甘露糖聚糖
 6, 3 
内切糖苷酶 H Endo
切割各种高甘露糖聚糖
 12, 13
β-半乳糖苷酶Exo去除 Gal-β1,3-GlcNAc、Gal-β1,4-GlcNAc、Galβ1,3 GalNAc 的末端半乳糖苷

 5、8、9
肽:N-糖苷酶 F
Endo
Asn 和 GlcNAc 之间的糖蛋白
10
 
唾液酸酶（神经氨酸酶）
Exo
 NeuAc-α2,6-Gal、NeuAc-α2,6-GlcNAc
或 NeuAc-α2,3-Gal 
 2
 

本表格改编自 T.A. Brown 的 Molecular Biology Labfax，已获得 BIOS Scientific Publishers Ltd 许可。

参考文献

  1. Alberts, B. et al.(1989) Molecular Biology of the Cell, second edition, Garland Publishing, Inc., New York, pp. 433-475.
  2. Ausubel, F.M. et al. eds.(1990) Current Protocols in Molecular Biology.Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York. pp. 17.0.1 to 17.14.9.
  3. Tarentino, A.L. et al.(1985) Biochemistry 24: 4665.
  4. Varki, A. and Freeze, H.H.(1994) Subcellular Biochem.22: 71.
  5. Distler, J.J. and Jourdian, G.W.(1973) J. Biol.Chem.248: 6772.
  6. Elder, J.H. and Alexander, S. (1982) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79: 4540.
  7. Kobata, A. (1979) Anal.Biochem.100: 1.
  8. Niemann, H. et al.(1984) EMBO J. 3: 665.
  9. O’Sullivan, M.J. and Marks, V. (1981) Meth.Enzymol.73: 147.
  10. Plummer, T.H. et al.(1984) J. Biol.Chem.259: 10700.
  11. Taniguchi, T.L. et al.(1986) J. Biol.Chem.261: 1730.
  12. Tarentino, A.L. and Maley, F. (1974) J. Biol.Chem.249: 811.
  13. Trimble, R.B. and Maley, F. (1984) Anal.Biochem.141: 515.
  14. Jarvis D.L. et al.(1995) Virology 212(2): 500-511.
  15. Duman, J.G. et al.(1998) Biotechnology And Applied Biochemistry 28 (Pt 1): 39-45.
  16. Gemmill, T.R. and Trimble, R.B.(1999) Biochimica Et Biophysica Acta 1426: 227.