诱导型蛋白表达——T-REx 系统

概述 Invitrogen T-REx 系统是一种四环素调节型哺乳动物表达系统，使用来自大肠杆菌 Tn10 编码的四环素 (Tet) 抗性操纵子的调节元件（Hillen 和 Berens，1994；Hillen 等人，1983）。T-REx 系统中的四环素调节基于四环素与 Tet 阻遏蛋白的结合以及对控制目标基因表达的启动子的去阻遏（Yao 等人，1998）。T-REx 系统的主要组分包括：

• 诱导型表达质粒，在人巨细胞病毒 (CMV) 即刻早期强启动子和两个四环素操纵子 2 (TetO2) 位点控制下表达目标基因
• 调节质粒 pcDNA6/TR™，在人 CMV 启动子的控制下编码 Tet 阻遏蛋白 (TetR)，四环素用于诱导表达
• 含有 lacZ 基因的对照表达质粒，当与 pcDNA6/TR™ 共转染时，在四环素诱导下表达 β-半乳糖苷酶。

有关诱导型表达载体和含有 lacZ 基因的相应阳性对照载体的具体信息，请参阅您所用的诱导型表达载体的手册。
 
T-REx 系统的描述

在 T-REx 系统中，没有四环素的情况下，目标基因的表达受到阻遏，在有四环素的情况下可诱导目标基因表达（Yao 等人，1998）。与使用杂交调节分子和病毒反式激活域的其他四环素调节系统（Gossen 和 Bujard，1992）不同，T-REx 系统仅使用来自天然 Tet 操纵子的调节元件（Yao 等人，1998）。T-REx 系统中四环素调节的基因表达更接近天然细菌 Tet 操纵子的调节（Hillen 和 Berens，1994；Hillen 等人，1983），并避免了在一些哺乳动物细胞系中观察到的病毒反式激活域的潜在毒性作用。
 
T-REx 系统的主要组分是诱导型表达质粒。诱导型表达载体的目标基因表达受 CMV 强启动子控制（Andersson 等人，1989；Boshart 等人，1985；Nelson 等人，1987），该启动子中已串联插入了2个拷贝的 Tet 操纵子 2 (TetO2) 序列。TetO2 序列由2个拷贝的19核苷酸序列 (5´-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3´) 组成，且这两个拷贝由包含2个碱基对的间隔区隔开（Hillen 和 Berens，1994；Hillen 等人，1983）。TetO2 的每个19核苷酸序列用作2个 Tet 阻遏蛋白分子的结合位点。有关 Tet 操纵子序列的更多信息以及各诱导型表达载体的具体特征，请参阅您所用的载体的手册。
 
T-REx 系统的第二种主要组分是 pcDNA6/TR 调节载体，其在人 CMV 启动子的控制下表达高水平的 TetR 基因（Postle 等人，1984）。这两种 T-REx 载体均可通过标准转染方法引入哺乳动物宿主细胞。

阻遏机制

在没有四环素的情况下，Tet 阻遏蛋白形成同源二聚体，后者以极高的亲和力与诱导型表达载体启动子中的每个 TetO2 序列结合（Hillen 和 Berens，1994）。诱导型表达载体启动子中的2个 TetO2 位点作为 Tet 阻遏蛋白的4个分子（或2个同源二聚体）的结合位点。Tet 阻遏蛋白对 Tet 操纵子的亲和力为 KB = 2 x 1011 M-1 （在生理条件下测量），其中 KB 是结合常数（Hillen 和 Berens，1994）。Tet 阻遏蛋白同源二聚体与 TetO2 序列的结合可阻遏目标基因转录。添加四环素后，四环素能够以 1:1 的化学计量比与每个 Tet 阻遏蛋白同源二聚体高亲和力结合，并引起阻遏蛋白构象变化，使其无法与 Tet 操纵子结合。四环素与 Tet 阻遏蛋白的缔合常数 KA 为 3 x 10⁹ M-1（Hillen 和 Berens，1994）。然后，Tet 阻遏蛋白:四环素复合物从 Tet 操纵子上解离，并诱导目标基因转录。 

实验概述

将目标基因克隆到诱导型表达载体的多克隆位点，并将所得构建体与调节质粒 pcDNA6/TR™ 共转染到哺乳动物细胞中。转染后，用四环素处理细胞，使诱导型表达载体中的杂交 CMV/TetO2 启动子去阻遏，并诱导目标基因转录。
 
可将含有 lacZ 基因的阳性对照载体与 pcDNA6/TR™ 瞬时共转染到哺乳动物细胞中，以证明该系统能在您的细胞系中正常工作。可以构建通过 pcDNA6/TR™ 表达 Tet 阻遏蛋白的稳定细胞系，作为基于诱导型表达载体的构建体的宿主。 

T-REx 系统手册随下列试剂盒一起提供。核心系统包括所选诱导型表达载体、调节载体和测序引物。完整系统包括核心系统以及诱导剂和筛选剂。每个 T-REx 试剂盒的组分详述见下文。

运输/储存

在室温下运输 T-REx 核心系统。在 -20℃ 下储存。
T-REx 完整系统分为2盒运输。储存方法如下：

• 包装盒1含有载体、引物和杀稻瘟菌素，在室温下运输。收货后，将载体和引物取出并储存于 -20℃ 下。杀稻瘟菌素粉末应储存于 +4℃ 下。
• 包装盒2含有四环素和 Zeocin，置于蓝冰上运输。在 +4℃ 下储存。如需长期储存（> 6个月），则置于 -20℃ 下。四环素和 Zeocin 应避光储存。 

试剂盒组分

T-REx 完整系统和 T-REx 核心系统均包括以下调节载体和测序引物。在 -20℃ 下储存。

诱导型表达载体

各 T-REx 完整系统和核心系统还包括以下一种诱导型表达载体和含有 lacZ 基因的相应阳性对照载体。有关各诱导型表达载体的具体信息，请参阅载体手册。在 -20℃ 下储存。

T-REx 细胞系

为方便您使用，Invitrogen 提供了三种可稳定表达 Tet 阻遏蛋白的哺乳动物细胞系。T-REx-293 细胞和 T-REx-HeLa 细胞通过 pcDNA6/TR™ 表达 Tet 阻遏蛋白，应在含有杀稻瘟菌素的培养基中维持培养。T-REx-U2OS 细胞通过 pCEP4/tetR 表达 Tet 阻遏蛋白（Yao 等人，1998），应在含有潮霉素的培养基中维持培养。请注意，T-REx-U2OS 细胞中的 pCEP4/tetR 质粒为游离型，但经潮霉素筛选时维持稳定。有关更多信息，请访问 www.thermofisher.com 或致电技术服务部门。

介绍

以下部分包含维持和增殖 pcDNA6/TR 调节载体的指南。
 
一般分子生物学技术

如需有关大肠杆菌转化、限制性内切酶分析、单链 DNA 纯化、DNA 测序和 DNA 生物化学方面的帮助，请参阅《分子克隆：实验室手册》（Sambrook 等人，1989）或《现行分子生物学方案》（Ausubel 等人，1994）。
 
大肠杆菌菌株
    
许多大肠杆菌菌株均适用于 pcDNA6/TR 载体增殖，包括 TOP10F´（货号 C615-00）、DH5αF´ 和 INVαF´（货号 C658?00）。我们建议您在重组缺陷 (recA) 和核酸内切酶 A 缺陷 (endA) 型大肠杆菌菌株中增殖 pcDNA6/TR 载体。
 
为方便您使用，Invitrogen 以化学感受态细胞或电转感受态细胞形式提供 TOP10F´ 大肠杆菌。

转化方法

您可以使用任一可选方法进行转化。化学转化对很多研究人员而言最为方便。电穿孔最有效且是转化大质粒的首选方法。
 
质粒维持

pcDNA6/TR™ 载体包含氨苄青霉素和杀稻瘟菌素抗性基因，因此可使用氨苄青霉素或杀稻瘟菌筛选质粒。为增殖和维持 pcDNA6/TR 质粒，我们建议遵循以下程序：
 

1. 将载体重悬于 20 µL 无菌水中，以制备 1 µg/µL 储备液。将储备液储存在 -20℃ 下。


2.  使用储备液转化 recA、endA 大肠杆菌菌株，如 TOP10F´、INVαF´ 或等同菌株。


3.  在含 50-100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板或含 50 µg/mL 杀稻瘟菌素的低盐 LB 琼脂平板上筛选转化体。


4. 制备每种质粒的甘油储备液以供长期储存（参见以下方案）。

 
大肠杆菌筛选

为便于筛选抗杀稻瘟菌素的大肠杆菌，培养基的盐浓度必须保持在较低水平 (< 90 mM)，pH 值必须为7.0。使用配方制备低盐 LB 肉汤和平板。 若未降低 LB 培养基的盐含量，除非使用较高浓度的杀稻瘟菌素。否则会导致因此药受抑制而无法筛选。
 
制备甘油储备液

鉴别出正确克隆后，请确保纯化菌落并制备甘油储备液，以供长期储存。另一项适当选择是，将您的质粒 DNA 储备液储存在 –20℃ 下。
 

1. 在含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上或含有 100 µg/mL 杀稻瘟菌素的低盐 LB 平板上划线接种原始菌落。在 37℃ 下过夜孵育平板。


2. 分离单个菌落，接种至 1-2 mL 含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基或含有 50 µg/mL 杀稻瘟菌素的低盐 LB 培养基中。


3. 让培养物生长至中对数阶段 (OD600 = 0.5-0.7)。


4. 取 0.85 mL 培养物与 0.15 mL 无菌甘油混合，然后转移至冻存管中。


5. 在 -80℃ 下储存。

 
质粒制备

用于转染真核细胞的质粒 DNA 必须非常纯净，不含苯酚和氯化钠。污染物会杀死细胞，而盐会干扰脂质，从而降低转染效率。我们建议使用 S.N.A.P.小提试剂盒（10-15 µg DNA，货号 K1900-01）、S.N.A.P.中提试剂盒（10-200 µg DNA，货号 K1910-01）或 CsCl 梯度离心分离 DNA。

介绍

获得诱导型表达质粒和 pcDNA6/TR™ 的纯净质粒制备物后，即可将这两种质粒共转染到所选哺乳动物细胞系中。我们建议您纳入阳性对照载体和转染试剂对照（阴性对照）以评价结果。有关阳性对照载体的更多信息，请参阅您所用的诱导型表达载体的手册。
 
转染方法
   
对于已建立的细胞系（如 HeLa、COS-1），请查阅原始参考文献或咨询您的细胞系供应商，以了解最佳转染方法。我们建议您严格遵循针对您的细胞系所制定的方案。应特别注意培养基要求，何时进行细胞传代，以及分流细胞所用的稀释比例。更多信息见《现行分子生物学方案》（Ausubel 等人，1994）。
 
转染方法包括磷酸钙法（Chen 和 Okayama，1987；Wigler 等人，1977）、脂质体介导法（Felgner 等人，1989；Felgner 和 Ringold，1989）和电穿孔转染法（Chu 等人，1987；Shigekawa 和 Dower，1988）。Invitrogen 提供用于哺乳动物细胞转染的磷酸钙转染试剂盒和用于脂质体介导转染的 Lipofectamine 2000 试剂。
 
减四环素血清

当在含有胎牛血清 (FBS) 的培养基中培养细胞时，请注意，许多批次 FBS 含有四环素，因为 FBS 通常从喂食含四环素饲料的母牛所产胎牛中分离得到。如果您在培养基含有未减少四环素含量的 FBS 情况下培养细胞，您可能在未添加四环素的情况下观察到目标基因的低水平基础表达。我们在培养基含有可能未减少四环素含量的 FBS情况下培养了哺乳动物细胞，并在未额外添加四环素的情况下观察到阳性对照载体呈现不可检出至极低水平的 β-半乳糖苷酶基础表达。如果您的目标基因产生有毒蛋白，您可能希望使用减四环素的 FBS 培养细胞。

有关更多信息，请联系我们的 Gibco FBS 销售代表，以找到适合您细胞培养需求的 FBS
 
四环素

四环素（分子量 = 444.4）通常用作广谱抗生素，用于通过阻滞细菌中多肽链延伸而抑制翻译。在 T-REx 系统中，四环素用作诱导剂，用于诱导源自诱导型表达载体的目标基因转录。四环素通过与 Tet 阻遏蛋白同源二聚体结合并导致阻遏蛋白发生构象变化使其无法与 Tet 操纵子结合，从而诱导转录。四环素与 Tet 阻遏蛋白的缔合常数为 3 x 109 M-1（Takahashi 等人，1991）。请注意，用于诱导 T-REx 系统中基因表达的四环素浓度通常不足以对哺乳动物细胞产生毒性。

• 四环素对光敏感。在 +4℃ 下避光储存粉状药物。在临用前制备含有四环素的培养基。
• 四环素有毒。请勿摄入或吸入粉末或含有此药的溶液。
• 处理四环素和含四环素的溶液时，请佩戴手套、穿上实验服以及佩戴防护眼镜或护目镜。

四环素制备

用完整试剂盒提供的四环素盐制备储备液：
 
  1.    称取 10 mg 四环素，转移至 15 mL 无菌聚丙烯锥形管中。
 
  2.    将 10 mg 四环素重悬于 10 mL 水中，得到 1 mg/mL 储备液，溶液为黄色。
 
备注： 如果您使用的是其他形式的四环素（即游离碱形式），请用 100% 乙醇重悬，而不用水重悬。
 
  3.    请在 -20℃ 下避光储存储备液。
 
因为在 T-REx 系统中四环素调节的表达基于阻遏/去阻遏机制，所以在宿主细胞系中来自 pcDNA6/TR 的 Tet 阻遏蛋白表达量将决定您的诱导型表达构建体中 Tet 操纵子序列的转录阻遏水平。Tet 阻遏蛋白水平应足以适当地阻遏基础水平的转录。我们改变了瞬时共转染到哺乳动物细胞中的 pcDNA6/TR 和诱导型表达质粒的比例，以优化诱导型表达质粒中杂交 CMV/TetO2 启动子的阻遏和可诱导性。我们建议您以至少 6:1 (w/w) 的 pcDNA6/TR:诱导型表达质粒 DNA 比例共转染哺乳动物宿主细胞系。
 

共转染和四环素诱导

下文介绍了将诱导型表达构建体（或对照质粒）与 pcDNA6/TR 共转染到哺乳动物细胞系中并使用四环素诱导目标蛋白表达的指南。由于各细胞系存在差异并可能需要不同的转染方法，因此可能需要通过开展一些经验性实验以确定诱导表达的最佳条件。
 

• 使用达到约 60% 汇合度的细胞进行转染。
• 使用您的首选方法，将 pcDNA6/TR 质粒和诱导型表达构建体以 6:1 (w:w) 的比例共转染到所选细胞系中。质粒的绝对量具体取决于转染方法和使用的细胞系。
• 转染后，加入新鲜培养基，待细胞恢复24小时后进行诱导。
• 移除培养基，向细胞中添加含有适当浓度四环素的新鲜培养基。通常，我们建议您向细胞中加入四环素至终浓度为 1 µg/mL（每 5 mL 培养基中加入 5 µL 的 1 mg/mL 储备液），并将细胞置于 37℃ 下孵育24小时。
• 收获细胞并检测基因表达。 

优化表达

您可能需要改变四环素的浓度 (0.1-1 µg/mL) 和暴露于四环素的时间（8-24 小时），以优化或调节细胞系的表达。
 
其他诱导剂

您可以在 T-REx 系统中使用多西环素作为替代诱导剂。多西环素的作用机制与四环素相似，在 T-REx 系统中具有与四环素相似的剂量效应和诱导特征。多西环素的半衰期长于四环素（分别为48小时和24小时）。多西环素可从 Sigma-Aldrich 购得（货号 D9891）。

介绍

确定您的构建体能够发生诱导性表达后，您可能希望构建一个组成性表达 Tet 阻遏蛋白并诱导表达目标基因的稳定细胞系。我们建议您首先构建一个仅表达 Tet 阻遏蛋白的稳定细胞系，然后使用该细胞系构建另一通过诱导表型达质粒表达目标基因的细胞系。或者，您可以同时转染两种质粒（pcDNA6/TR 和诱导型表达载体）并使用杀稻瘟菌素和 Zeocin 进行双重筛选，以分离同时表达 Tet 阻遏蛋白和目标基因的单个稳定细胞系。
 
稳定表达 Tet 阻遏蛋白的三种 T-REx 细胞系可从 Invitrogen 购得。如果您希望在293细胞、HeLa 细胞或 U2OS 细胞中测定四环素诱导目标基因表达的水平，您可能要使用其中一种 T-REx 细胞系作为宿主来建立双重稳定细胞系。有关更多信息，请访问 www.invitrogen.com 或致电技术服务部门。

提醒：生成表达 Tet 阻遏蛋白的稳定细胞系时，您需要筛选 Tet 阻遏蛋白表达水平最高的克隆作为诱导型表达构建体的宿主。Tet 阻遏蛋白表达水平最高的克隆应能最完全地阻遏目标基因的基础转录。
 
抗生素敏感性测定

为成功生成表达 Tet 阻遏蛋白和目标蛋白的稳定细胞系，您需要确定杀死未转染的宿主细胞系所需的各抗生素（杀稻瘟菌素和 Zeocin）的最低浓度。对于每种抗生素，对一系列浓度（见下文）进行试验，以确保您能够确定细胞系所需的最低浓度。使用以下方案，确定防止亲本细胞系生长所需的 Zeocin 和杀稻瘟菌素的最低浓度。关于如何制备和储存杀稻瘟菌素的说明，请参见第14页的附录。关于如何制备和储存 Zeocin 的说明，请参见诱导型表达载体手册。

1. 铺板或分流汇合的培养板，从而细胞达到约 25% 汇合度。对于每种抗生素，准备一组 6-7 个平板。向同组各平板中加入以下浓度的抗生素：
   • 对于杀稻瘟菌素筛选，试验浓度包括 0、1、3、5、7.5 和 10 µg/mL 杀稻瘟菌素
   • 对于 Zeocin 筛选，试验浓度包括 0、50、125、250、500、750 和 1000 µg/mL Zeocin


2. 每 3–4 天补充一次选择性培养基，并观察存活细胞的百分比。


3. 定期对活细胞进行计数，以确定抗生素的适当浓度，从而能在添加抗生素后 1-2 周内阻止细胞生长。

Zeocin 对敏感细胞和抗性细胞的影响

Zeocin 的杀伤方法与其他抗生素（包括杀稻瘟菌素、新霉素和潮霉素）截然不同。细胞不会变圆和从培养板上分离。敏感细胞暴露于 Zeocin 后可能表现出以下形态变化：

• 大小显著增加（类似于巨细胞病毒感染允许细胞的影响）
• 细胞形状异常
• 细胞质中存在大空囊泡（内质网和高尔基体或其他支架蛋白分解）
• 质膜和核膜分解（这些膜上出现许多孔）
• 最终这些"细胞"将完全分解，仅留下蛋白质"串"。
• Zeocin 抗性细胞应能够继续定期分裂，形成明显的集落。与未经 Zeocin 筛选的细胞相比，Zeocin 抗性细胞不应存在任何明显的形态变化。有关 Zeocin 及其作用机制的更多信息，请参见诱导型表达载体手册。

用于 pcDNA6/TR 线性化的可能位点 
      
为获得稳定的转染子，您可以选择在转染前对 pcDNA6/TR 进行线性化。虽然线性化载体可能不会提高转染效率，但可增加载体在整合时不会对 Tet 阻遏蛋白基因或哺乳动物细胞表达所需的其他元件产生干扰的可能性。下表列出了可用于在转染前对您的构建体进行线性化的独特位点。还可使用其他限制性酶切位点。

筛选稳定整合子

确定用于筛选的适当抗生素浓度后，您可生成表达 pcDNA6/TR 和诱导型表达构建体的稳定细胞系。
 

1. 使用所需方案，用 pcDNA6/TR 转染哺乳动物细胞。请记住，纳入一块包含未转染细胞的培养板作为阴性对照。


2. 转染后24小时，洗涤细胞并向细胞中加入新鲜培养基。


3. 转染后48小时，将细胞分流转移至含有细胞系所需预定浓度杀稻瘟菌素的新鲜培养基中。分流细胞以使细胞汇合度不超过 25%。如果细胞密度太高，抗生素将不会杀死细胞。抗生素对于分裂活跃的细胞的作用最佳。


4. 每 3-4 天为细胞补加选择性培养基，直至可识别集落。


5. 采用表达 β-半乳糖苷酶的阳性对照质粒瞬时转染，挑取至少20个细胞集落并扩增，以检测四环素诱导性基因表达。筛选基础转录水平最低和在加入四环素后 β-半乳糖苷酶表达水平最高的克隆。


6. 获得表达 Tet 阻遏蛋白的稳定细胞系后，您可使用此细胞系分离通过诱导型表达质粒表达目标基因的稳定细胞系。重复上述步骤 1-4，使用您的诱导型表达载体构建体和 Zeocin 筛选细胞集落。请记住同样要在含杀稻瘟菌素的培养基中维持培养您的细胞。


7. 挑取并扩增至少20个细胞集落，以检测四环素调节的基因表达。

双重筛选稳定整合子

我们建议使用上述方案生成双重稳定细胞系。但是，如果您想进行双重筛选，您可以同时将 pcDNA6/TR 和诱导型表达构建体共转染到所选细胞系中。共转染细胞系时，我们建议至少使用 6:1 (w/w) 的 pcDNA6/TR DNA:诱导型表达质粒 DNA 比例，以增加双重稳定细胞系充分表达 Tet 阻遏蛋白的概率。按照上述步骤，加入含有预定浓度杀稻瘟菌素和 Zeocin 的选择性培养基。使用适当的蛋白质分析方法（如蛋白质印迹法、酶反应分析法），筛选至少40个受四环素调节目标基因表达的细胞集落。 

分离出同时表达 pcDNA6/TR™ 和诱导型表达构建体的稳定细胞系并检测四环素诱导性目标基因表达后，我们建议您设定一个四环素诱导时间段来优化目标蛋白的表达（如，0、8、16、24、32小时等）。在您的细胞系中使用先前确定的适当浓度四环素。在使用 1 µg/mL 四环素处理24小时后，我们在双重稳定细胞系（用含有 lacZ 基因的阳性对照质粒转染的 T-REx 293 细胞）中观察到多达120倍的 β-半乳糖苷酶诱导。请注意，诱导水平可能因您的目标基因的性质以及您选择的特定克隆而异。

pcDNA6/TR 图谱

pcDNA6/TR 是一种 6662 bp 载体，在人 CMV 启动子的控制下表达 Tet 阻遏蛋白。单击此处以下载该载体特征的总结图。如需 pcDNA6/TR 的完整序列，可从 www.thermofisher.com 下载或联系技术服务部门。

TetR 基因

pcDNA6/TR 中使用的 TetR 基因最初分离自 Tn10 转座子，其使得大肠杆菌和其他肠道细菌对四环素产生耐药性（Postle 等人，1984）。来自 Tn10 的 TetR 基因编码 B 类 Tet 阻遏蛋白，在文献中通常称为 TetR(B)（Hillen 和 Berens，1994）。 
 
TetR 基因编码包含207个氨基酸的阻遏蛋白，计算得出的分子量为 23 kDa。有关 Tet 阻遏蛋白及其与 Tet 操纵子相互作用的更多信息，请参见 Hillen 和 Berens 的综述 (1994)。
 
pcDNA6/TR 的特征

下表描述了 pcDNA6/TR 的相关特征。该载体包括可增强 TetR 基因表达的兔 β-珠蛋白内含子 II。有关 TetR 基因和 Tet 阻遏蛋白的详细信息，请参见上一页。所有特征均经过功能检测。

杀稻瘟菌素 S HCl 是从灰色链霉菌中分离得到的核苷类抗生素，可抑制原核细胞和真核细胞中的蛋白质合成（Takeuchi 等人，1958；Yamaguchi 等人，1965）。表达以下两种杀稻瘟菌素 S 脱氨酶基因中的任一种即可产生抗性：来自土曲霉的 bsd（Kimura 等人，1994）或来自蜡样芽孢杆菌的 bsr（Izumi 等人，1991）。这些脱氨酶将杀稻瘟菌素 S 转换为无毒脱氨基羟基衍生物（Izumi 等人，1991）。
 
分子量、分子式和结构

杀稻瘟菌素 S 的分子式为 C17H26N8O5-HCl，分子量为458.9。杀稻瘟菌素的结构见下图。






处理杀稻瘟菌素

处理杀稻瘟菌素时，请始终佩戴手套、面罩、护目镜和防护服（如实验服）。在通风柜中称量杀稻瘟菌素并制备溶液。
 
制备和储存储备液

杀稻瘟菌素随 T-REx 完整试剂盒提供，但也可从 Invitrogen 单独购买 50 mg 等分试样（货号 R210-01）。杀稻瘟菌素可溶于水。通常使用无菌水制备 5-10 mg/mL 储备液。

• 将杀稻瘟菌素溶于无菌水中并对溶液进行过滤除菌。
• 以适合一次使用的小体积分装（参见下一要点至最后一个要点），在 -20℃ 下冻存以供长期储存或在 +4℃ 下短期储存。
• 水性储备液在 +4℃ 下可维持储存 1-2 周，在 -20℃ 下可维持储存 6-8 周。
• 水性溶液的 pH 值应为7.5，以防止杀稻瘟菌素失活。
• 储备液不得经历冻融循环（请勿储存于无霜冰箱中）。
• 解冻后按需要使用，解冻后的储备液可在 +4℃ 下储存最多2周。
• 包含杀稻瘟菌素时可在 +4℃ 下储存最多2周。

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