使用 Flp-In™ T-Rex™ 系统生成同基因表达细胞系

 概述

利用 Flp-In™ T-REx™ 系统可生成从特定基因组位置进行四环素诱导性目标基因表达的稳定哺乳动物细胞系。为生成这些细胞系，使用 Flp-In™ T-REx™ 系统时包含以下主要步骤：

1. 将两种质粒独立地整合到所选哺乳动物细胞系的基因组中，生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系


2. 通过 Flp 重组酶介导的 FRT 位点处 DNA 重组，在四环素诱导性启动子的控制下，将含有您目标基因的表达载体整合到基因组中（O'Gorman 等人，1991）


3. 通过添加四环素诱导目标基因

            a.   包含 Flp 重组靶标 (FRT) 位点的质粒
            b.   表达 Tet 阻遏蛋白的质粒

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系统的主要组分

Flp-In™ T-REX™ 系统的主要组分包括：

• Flp-In™ 靶标位点载体 pFRT/lacZeo，用于生成包含整合 FRT 位点的 Flp-In™ 宿主细胞系
• Tet 阻遏蛋白表达质粒 pcDNA6/TR，用于在人 CMV 启动子的控制下表达 Tet 阻遏蛋白
• 含有与潮霉素抗性基因相连的 FRT 位点的表达质粒，用于在四环素调节的 CMV/TetO2 启动子的控制下，对表达目标基因的稳定细胞系进行 Flp 重组酶介导的整合和筛选
• Flp 重组酶表达质粒 pOG44，用于在人 CMV 启动子的控制下表达 Flp 重组酶
• 含有氯霉素乙酰转移酶 (CAT) 基因的对照表达质粒，当与 pOG44 共转染到 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系中时，在四环素诱导下表达 CAT

 
Flp-In™ T-REx™ 系统的优势

使用 Flp-In™ T-REx™ 系统生成稳定表达的细胞系具有许多优势，具体如下：

• 创建包含整合 FRT 位点的 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系后，随后即可快速、高效生成表达目标基因的 Flp-In™ T-REx™ 细胞系。
• 利用 Flp-In™ T-REx™ 系统可生成同基因、诱导型稳定细胞系。
• Flp-In™ T-REx™ 系统可多克隆筛选稳定表达的细胞系。

 
 
生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系

Flp-In™ T-REx™ 系统利用酿酒酵母来源 DNA 重组系统，简化了诱导型哺乳动物稳定表达细胞系的生成过程。该 DNA 重组系统使用重组酶 (Flp) 和位点特异性重组（Craig，1988；Sauer，1994），有助于将目标基因整合至哺乳动物细胞基因组中的特定位点上。

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为生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系，您需将两种质粒先后转染到所选哺乳动物细胞系中：

1. pFRT/lacZeo 靶标位点载体：pFRT/lacZeo 载体包含 lacZ-Zeocin™ 融合基因，其表达受到 SV40 早期启动子的控制。已插入的 FRT 位点刚好位于 lacZ-Zeocin™ 融合基因 ATG 起始密码子的下游。FRT 位点作为 Flp 重组酶的结合和切割位点。使用 pFRT/lacZeo 转染后，用 Zeocin™ 筛选细胞。筛选 Zeocin™ 抗性克隆，以识别含有单一整合 FRT 位点的克隆。由此所得的 Flp-In™ 宿主细胞系含有单一整合 FRT 位点并表达 lacZ-Zeocin™ 融合基因（参见下图）。


2. pcDNA6/TR：pcDNA6/TR 质粒在人 CMV 启动子的控制下组成性表达 Tet 阻遏蛋白（参见下图）。 

备注：  将 pFRT/lacZeo 和 pcDNA6/TR 质粒整合到基因组中的过程是随机过程且独立发生。
 
 
生成诱导型表达细胞系

生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系后，您将通过 Flp 重组酶介导的 FRT 位点处 DNA 重组将含有目标基因的 pcDNA5/FRT/TO 表达载体整合至细胞中（O'Gorman 等人，1991）。该步骤需要下列质粒：

1. pcDNA5/FRT/TO 表达载体：pcDNA5/FRT/TO 质粒包含您的目标基因，受四环素调节的杂交人巨细胞病毒 (CMV)/TetO2 启动子控制。该载体还包含潮霉素抗性基因，FRT 位点嵌在其 5' 编码区。潮霉素抗性基因缺乏启动子和 ATG 起始密码子。


2. pOG44：pOG44 质粒组成性表达 Flp 重组酶（Broach 等人，1982；Broach 和 Hicks，1980；Buchholz 等人，1996），受人 CMV 启动子的控制。

将 pOG44 质粒和含有目标基因的 pcDNA5/FRT/TO 载体共转染到 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系中。共转染后，pOG44 表达的 Flp 重组酶介导 FRT 位点之间的同源重组事件（整合到基因组中和 pcDNA5/FRT/TO 上），从而在整合的 FRT 位点处将 pcDNA5/FRT/TO 构建体插入基因组中（参见下图）。在 FRT 位点处将 pcDNA5/FRT/TO 插入基因组中，使得 SV40 启动子和 ATG 起始密码子（源自 pFRT/lacZeo）靠近且位于含潮霉素抗性基因的框内，并使得 lacZ-Zeocin™ 融合基因失活（参见下图）。因此，可通过以下表型筛选 Flp-In™ T-REx™ 稳定表达细胞系：

• 杀稻瘟菌素抗性
• 潮霉素抗性
• Zeocin™ 敏感性
• 缺乏 ß-半乳糖苷酶活性

将 pcDNA5/FRT/TO 载体稳定整合到基因组中的 FRT 位点后，即可通过添加四环素诱导重组目标蛋白表达。有关四环素诱导目标基因表达机制的更多信息，请见下文。
 
Flp-In™ T-REx™ 系统示意图

下图说明了前文所述 Flp-In™ T-REx™ 系统的主要特征。

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Flp 重组酶介导的 DNA 重组

在 Flp-In™ T-REx™ 系统中，通过 Flp 重组酶介导的分子间 DNA 重组，将 pcDNA5/FRT/TO 表达构建体整合到基因组中。Flp 介导的重组标志如下所示。

• 重组发生在相互作用的 DNA 分子上的特定 FRT 位点（见下文）之间
• 重组具有保守性，不需要 DNA 合成；重组后保留了 FRT 位点，在重组位点引入突变的可能性极小
• 链交换仅需最小 34 bp 的小型 FRT 位点（见下文）

有关 Flp 重组酶和保守位点特异性重组的更多信息，请参阅发表的综述（Craig，1988；Sauer，1994）。

备注：  如果您的细胞系包含多个整合的 FRT 位点，则也可能发生 Flp 介导的分子内重组。分子内重组可能导致：

• 当 FRT 位点直接重复（即在同一条 DNA 链上整合了多个 FRT 位点）时，切除居间 DNA
• 当位点方向相反时，倒置 DNA
• 基因组序列缺失

FRT 位点

如上所述，Flp 重组酶介导的重组发生于特定 FRT 位点之间。FRT 位点最初从酿酒酵母中分离得到，用作 Flp 重组酶的结合位点且已经过充分表征（Gronostajski 和 Sadowski，1985；Jayaram，1985；Sauer，1994；Senecoff 等人，1985）。最小的 FRT 位点由一个 34 bp 序列组成，其中包含两个 13 bp 不完全反向重复序列，由包括一个 Xba I 限制性酶切位点的 8 bp 间隔区隔开（参见下图）。在大多数 FRT 位点发现了另外一个 13 bp 的重复序列，但不需要切割（Andrews 等人，1985）。虽然 Flp 重组酶与所有3个 13 bp 重复序列结合，但实际上在 8 bp 间隔区的边界处发生链切割（切割位点 [CS] 见下图）（Andrews 等人，1985；Senecoff 等人，1985）。




Flp-In™ T-REx™ 系统中的四环素调节

Flp-In™ T-REx™ 系统使用大肠杆菌 Tn10 编码的四环素 (Tet) 抗性操纵子中的调节元件（Hillen 和 Berens，1994；Hillen 等人，1983），可通过四环素调节 pcDNA5/FRT/TO 表达目标基因。该系统中的四环素调节机制基于四环素与 Tet 阻遏蛋白的结合以及对控制目标基因表达的启动子的去阻遏（Yao 等人，1998）。在该系统中，没有四环素的情况下，目标基因的表达受到阻遏，在有四环素的情况下可诱导目标基因表达（Yao 等人，1998）。

pcDNA5/FRT/TO 载体的目标基因表达受人巨细胞病毒 (CMV) 启动子控制，该启动子中已插入看 Tet 操纵子 2 (TetO2) 序列的2个串联拷贝。TetO2 序列由2个拷贝的19核苷酸序列组成：

5´-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3´
由包含2个碱基对的间隔区隔开（Hillen 和 Berens，1994；Hillen 等人，1983）。TetO2 的每个19核苷酸序列用作2个 Tet 阻遏蛋白分子的结合位点。
 
 
阻遏/去阻遏机制

在没有四环素的情况下，Tet 阻遏蛋白（通过 pcDNA6/TR 质粒表达）形成同源二聚体，后者以极高的亲和力与 pcDNA5/FRT/TO 载体启动子中的每个 TetO2 序列结合（Hillen 和 Berens，1994）。pcDNA5/FRT/TO 启动子中的2个 TetO2 位点作为 Tet 阻遏蛋白的4个分子（或2个同源二聚体）的结合位点（参见下图）。Tet 阻遏蛋白对 Tet 操纵子的亲和力为 KB = 2 x 1011 M-1 （在生理条件下测量），其中 KB 是结合常数（Hillen 和 Berens，1994）。Tet 阻遏蛋白同源二聚体与 TetO2 序列的结合可阻遏目标基因转录。添加四环素后，四环素能够以 1:1 的化学计量比与每个 Tet 阻遏蛋白同源二聚体高亲和力结合，并引起阻遏蛋白构象变化，使其无法与 Tet 操纵子结合。四环素与 Tet 阻遏蛋白的缔合常数 KA 为 3 x 109 M-1（Hillen 和 Berens，1994）。然后，Tet 阻遏蛋白:四环素复合物从 Tet 操纵子上解离，并允许诱导目标基因转录（参见下图）。
 
四环素调节示意图
下图显示了 Flp-In™ T-REx™ 系统中受四环素调节的目标基因阻遏和去阻遏机制。

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实验概述

为创建在位点特异性基因座处稳定表达目标基因的 Flp-In™ T-REx™ 细胞系，您要执行以下步骤（参见下图）。

1. 将 Flp-In™ 靶标位点载体 pFRT/lacZeo 转染到所选哺乳动物细胞系中，并筛选包含单个 FRT 位点的整合子。


2. 将 Tet 阻遏蛋白表达质粒 pcDNA6/TR 转染到单位点整合子（步骤1）中以生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系。


3. 将您的目标基因克隆到 pcDNA5/FRT/TO 表达载体中。


4. 将 pcDNA5/FRT/TO 构建体和 Flp 重组酶表达载体 pOG44 共转染到 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系中，以生成 Flp-In™ T-REx™ 表达细胞系。


5. 用四环素诱导目标基因表达。


6. 检测目标重组蛋白的表达情况。

备注：  可将含 CAT 基因的阳性对照载体与 pOG44 共转染到 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系中，以证明系统正常工作。
 
实验概述图

下图说明了生成 Flp-In™ T-REx™ 表达细胞系所需的主要步骤。
 

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介绍

以下部分包含维持和增殖 pFRT/lacZeo、pcDNA6/TR 和 pOG44 载体的指南。有关维持和增殖 pcDNA5/FRT/TO 表达载体的信息，请参阅载体手册。
 
一般分子生物学技术

如需有关大肠杆菌转化、限制性内切酶分析、DNA 生物化学和质粒制备方面的帮助，请参阅《分子克隆：实验室手册》（Sambrook 等人，1989）或《现行分子生物学方案》（Ausubel 等人，1994）。
 
大肠杆菌菌株

许多大肠杆菌菌株均适用于 pFRT/lacZeo、pcDNA6/TR 和 pOG44 载体增殖。我们建议您在重组缺陷 (recA) 和核酸内切酶 A 缺陷 (endA) 型大肠杆菌菌株中增殖载体。为方便您使用，现可提供 TOP10 和 DH5a™-T1R 大肠杆菌化学感受态细胞或电转感受态（仅 TOP10）细胞。

转化方法

您可以使用任一可选方法进行转化。化学转化对很多研究人员而言最为方便。电穿孔最有效且是转化大质粒的首选方法。
 
质粒维持

pFRT/lacZeo、pcDNA6/TR 和 pOG44 载体包含氨苄青霉素基因，因此可使用氨苄青霉素筛选质粒。

备注：pcDNA6/TR 质粒还包含杀稻瘟菌素抗性基因，因此可使用杀稻瘟菌素进行筛选。

为增殖和维持 pFRT/lacZeo、pcDNA6/TR 和 pOG44 质粒，我们建议遵循以下程序：

1. 将各载体重悬于 20 µL 无菌水中，以制备 1 µg/µL 储备液。将储备液储存在 -20℃ 下。


2. 使用储备液转化 recA、endA 大肠杆菌菌株，如 TOP10、DH5a™-T1R、JM109 或等同菌株。


3. 在含 50-100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上筛选转化体。为快速、简便微波制备含氨苄青霉素的低盐 LB 琼脂，赛默飞世尔科技可提供 imMedia™ Amp 琼脂（货号 Q601-20）。有关更多信息，请致电技术服务部门。


4. 制备含质粒的各转化体的甘油储备液，以供长期储存。

 

使用杀稻瘟菌素在大肠杆菌中筛选 pcDNA6/TR

为使用杀稻瘟菌素筛选法在大肠杆菌中增殖并维持 pcDNA6/TR 质粒，请遵循上述方案中的步骤1和2。在含 100 μg/mL 杀稻瘟菌素的低盐 LB 琼脂平板上筛选转化体。

备注：  为便于筛选抗杀稻瘟菌素的大肠杆菌，LB 培养基的盐浓度必须保持在较低水平 (< 90 mM)，pH 值必须为7.0。若未降低 LB 培养基的盐含量，除非使用较高浓度的杀稻瘟菌素。否则会导致因此药受抑制而无法筛选。
 
制备甘油储备液

鉴别出正确克隆后，请确保纯化菌落并制备甘油储备液，以供长期储存。另一项适当选择是，将您的质粒 DNA 储备液储存在 –20℃ 下。

1. 在含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板上划线接种初始菌落。在 37℃ 下过夜孵育平板。


2. 分离单个菌落，接种至 1-2 mL 含有 50 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中。


3. 让培养物生长至中对数阶段 (OD600 = 0.5–0.7)。


4. 取 0.85 mL 培养物与 0.15 mL 无菌甘油混合，然后转移至冻存管中。


5. 在 -80℃ 下储存。     

介绍

在创建可诱导性表达目标基因的稳定 Flp-In™ T-REx™ 细胞系之前，您首先需要生成稳定的 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系。通过将 pFRT/lacZeo 和 pcDNA6/TR 质粒独立转染到目标哺乳动物细胞系中，您将生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系。生成后，Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系将具有以下特征：

• 包含单一整合 FRT 位点（通过转染 pFRT/lacZeo 质粒而引入）
• 稳定表达 Tet 阻遏蛋白（通过转染 pcDNA6/TR 质粒而引入）

本部分提供了生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系的指南。
 
实验概述

下表概述了生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系所需的步骤。虽然可以共转染 pFRT/lacZeo 和 pcDNA6/TR，但我们建议您首先生成包含单一整合 FRT 位点（源自 pFRT/lacZeo）的稳定细胞系，然后将该细胞系作为 pcDNA6/TR 质粒的宿主。

提醒：生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系后，细胞就应表现出以下表型：

• Zeocin™ 抗性
• β-半乳糖苷酶活性
• 杀稻瘟菌素抗性
• 表达 Tet 阻遏蛋白

 
赛默飞世尔科技可提供 Flp-In™ T-REx™-293 宿主细胞系，其包含单一整合 FRT 位点并且稳定表达 Tet 阻遏蛋白。如果您希望在293细胞中诱导性表达目标基因，您可以使用此细胞系作为宿主并直接生成稳定表达的细胞系。另外，还可提供多个包含单一整合 FRT 位点的 Flp-In™ 宿主细胞系。您可以将 pcDNA6/TR 质粒转染到这些细胞系中以生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系。

有关 Flp-In™ T-REx™-293 细胞系或 Flp-In™ 细胞系的更多信息，请访问我们的网站或致电技术服务部门。
 
当将基于 pcDNA5/FRT 的表达构建体引入 Flp-In™-3T3 或 Flp-In™-BHK 细胞时，我们观察到病毒 CMV 启动子下调和随后的基因表达损失。我们建议您不要使用 3T3 或 BHK 细胞生成 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系。
 
质粒制备

用于转染真核细胞的质粒 DNA 必须非常纯净，不含苯酚和氯化钠。污染物会杀灭细胞，盐会干扰脂质体复合，从而降低转染效率。我们建议使用 S.N.A.P.™ 小提试剂盒（10-15 mg DNA，货号 K1900-01）、S.N.A.P.™ 中提试剂盒（10-200 mg DNA，货号 K1910-01）或 CsCl 梯度离心分离 DNA。

 
转染方法

对于已建立的细胞系（如 HeLa、COS-1），请查阅原始参考文献或咨询您的细胞系供应商，以了解最佳转染方法。我们建议您严格遵循针对您的细胞系所制定的方案。应特别注意培养基要求，何时进行细胞传代，以及分流细胞所用的稀释比例。更多信息见《现行分子生物学方案》（Ausubel 等人，1994）。 转染方法包括磷酸钙法（Chen 和 Okayama，1987；Wigler 等人，1977）、脂质体介导法（Felgner 等人，1989；Felgner 和 Ringold，1989）和电穿孔转染法（Chu 等人，1987；Shigekawa 和 Dower，1988）。我们提供磷酸钙转染试剂盒（货号 K2780-01）和多种脂质试剂用于哺乳动物细胞转染。有关可用试剂的更多信息，请访问我们的网站或致电技术服务部门。
 
Zeocin™

pFRT/lacZeo 质粒包含受 SV40 早期启动子控制的 lacZ-Zeocin™ 融合基因。基于 lacZ-Zeocin™ 融合基因的表达，可使用 Zeocin™ 抗生素筛选稳定的整合子。然后可通过检测 β-半乳糖苷酶表达筛选所得的稳定整合子。
 
 
Zeocin™ 敏感性测定

为成功生成含有整合 FRT 位点并表达 β-半乳糖苷酶-Zeocin™ 融合蛋白的稳定细胞系，您需要确定杀死未转染的哺乳动物细胞系所需的 Zeocin™ 最低浓度。通常，50-1000 µg/mL 浓度范围内的 Zeocin™ 足以杀死大多数未转染的哺乳动物细胞系，平均浓度为 100-400 µg/mL。我们建议您对一系列浓度（参见下文方案）进行试验，以确保您能够确定细胞系所需的最低浓度。 铺板或分流汇合的培养板，从而细胞达到约 25% 汇合度。制备一组7个平板。让细胞贴壁过夜。

1. 第二天，移除培养基，加入含有不同浓度 Zeocin™（0、50、100、250、500、750 和 1000 mg/mL Zeocin™）的培养基。


2. 每 3–4 天补充一次选择性培养基，并观察存活细胞的百分比。


3. 请注意要定期计算存活细胞的百分比，以确定 Zeocin™ 的适当浓度，从而能在添加 Zeocin™ 后 1-2 周内杀死细胞。

 
Zeocin™ 对敏感细胞和抗性细胞的影响

Zeocin™ 的杀伤方法与其他抗生素（包括潮霉素、G418 和杀稻瘟菌素）截然不同。细胞不会变圆和从培养板上分离。敏感细胞暴露于 Zeocin™ 后可能表现出以下形态变化：

• 大小显著增加（类似于巨细胞病毒感染允许细胞的影响）
• 细胞形状异常
• 细胞质中存在大空囊泡（内质网和高尔基体或其他支架蛋白分解）
• 质膜和核膜分解（这些膜上出现许多孔）

最终这些"细胞"将完全分解，仅留下蛋白质"串"。Zeocin™ 抗性细胞应能够继续定期分裂，形成明显的集落。与未经 Zeocin™ 筛选的细胞相比，Zeocin™ 抗性细胞不应存在任何明显的形态变化。
 
 
转染考虑因素

确定用于筛选的 Zeocin™ 适当浓度后，即可将 pFRT/lacZeo 质粒转染进您所选择的哺乳动物细胞系中。开始之前，您需要考虑以下因素：

• 将 FRT 位点插入基因组：将含有 FRT 位点的 pFRT/lacZeo 质粒整合到基因组中的过程是随机过程。随后通过在基因组 FRT 位点处进行 Flp 重组酶介导的重组，整合含有目标基因的 pcDNA5/FRT/TO 表达质粒。
• 细胞系的转染效率：大多数用户的目标是创建包含单一整合 FRT 位点的稳定细胞系（“单一整合子”见下面的备注）。获得包含单一 FRT 位点或多个 FRT 位点的稳定整合子的概率取决于您的细胞系的转染效率和转染的 DNA 量。为提高获得单一整合子的可能性，您需要通过限制要转染的质粒 DNA 数量来降低转染效率 
• 筛选集落：您可以通过将细胞铺于含有 Zeocin™ 的培养基中来筛选稳定转染子。然后可通过 Southern 印迹分析法筛选 Zeocin™ 抗性集落，以识别单一整合子。为增加获得单一整合子的机会，我们建议您从已转染最少量质粒 DNA 的培养板中挑选集落。
• 染色体位置效应：由于将 pFRT/lacZeo 质粒整合到基因组中的过程是随机过程，因此lacZ-Zeocin™ 融合基因的表达水平将取决于整合位点周围序列的转录活性（即染色体位置效应）。获得单一整合子后，您可能需要筛选出 b-半乳糖苷酶表达水平最高的 Zeocin™ 抗性克隆。

β-半乳糖苷酶应包含单一 FRT 位点，且该位点已被整合到转录活性最高的区域中。

• 抗生素浓度：单一整合子只能表达 lacZ-Zeocin™ 融合基因的单拷贝，因此与多重整合子相比对 Zeocin™ 筛选更敏感。如果您之前曾使用哺乳动物细胞系进行转染和 Zeocin™ 筛选，请注意，您可能需要使用较低浓度的 Zeocin™ 以获得单一整合子。

 
转染效率取决于细胞系的性质和转染的 DNA 量，因此可能生成含有多个整合 FRT 位点的细胞系。理论上，将 pcDNA5/FRT/TO 构建体和 pOG44 共转染到这些细胞中时，能够将您的目标基因整合到多个基因座中。我们不建议生成含有多个整合 FRT 位点的 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系，原因如下：

• 由于您的目标基因表达基于阻遏/去阻遏机制，因此如果表达质粒能够整合到多个基因座中，在 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系中产生的 Tet 阻遏蛋白量可能不足以阻遏您的基因的基础转录。
• 可能更难使用四环素适当调节目标基因表达。
• 基因组中存在多个整合 FRT 位点时可能会增加宿主细胞系中染色体重排或异常重组事件的发生率。

 
建议

如前所述，我们建议您使用有限量的 pFRT/lacZeo 质粒转染哺乳动物细胞系。我们通常使用 250 ng - 2 µg 质粒 DNA/ 4 x 10⁶ 个细胞进行转染，但是质粒 DNA 的量可能因细胞系的性质、细胞的转染效率以及所用的转染方法而异。转染所选哺乳动物细胞系时，我们建议您尝试使用多种质粒 DNA 浓度（如 0.25、0.5、1、2、5 µg/µL DNA）以优化细胞系的转染条件。

我们通常使用电穿孔法转染细胞，但是其他转染方法也适用。有关电穿孔细胞的方案，请参阅《现行分子生物学方案》9.3 单元（Ausubel 等人，1994）。请注意，如果您使用磷酸钙或脂质介导的转染方法，转染所需的总 DNA 量通常高于电穿孔法（通常为 10-20 mg DNA）。根据您用于转染的 pFRT/lacZeo 质粒量，您可能需要用载体 DNA（如鲑鱼精子 DNA）来补充质粒 DNA。
 
用于 pFRT/lacZeo 线性化的可能位点

为获得稳定的转染子，我们建议在转染前对 pFRT/lacZeo 质粒进行线性化。虽然线性化载体可能不会提高转染效率，但可增加载体在整合时不会对 ATG-FRT-lacZ-Zeocin™ 基因盒或哺乳动物细胞表达所需的其他元件产生干扰的可能性。下表列出了可用于在转染前对您的构建体进行线性化的独特位点。还可使用其他限制性酶切位点。

备注：我们通常使用 Sca I 对 pFRT/lacZeo 进行线性化。

*Angewandte Gentechnologie Systeme


筛选稳定的 pFRT/lacZeo 整合子      

                                                                                                                   
确定用于筛选的 Zeocin™ 适当浓度后，您可以使用 pFRT/lacZeo 生成稳定的细胞系。

1. 使用所需方案，用适当量的 pFRT/lacZeo 转染哺乳动物细胞。请记住，纳入一块包含未转染细胞的培养板作为阴性对照。


2. 转染后24小时，洗涤细胞并向细胞中加入新鲜培养基。


3. 转染后48小时，将细胞分流转移至新鲜培养基中。分流细胞以使细胞汇合度不超过 25%。如果细胞密度太高，抗生素将不会杀死细胞。抗生素对于分裂活跃的细胞的作用最佳。


4. 在 37℃ 下孵育细胞 2-3 小时，直至其附着在培养皿上。


5. 移除培养基，添加含有细胞系所需预定浓度 Zeocin™ 的新鲜培养基。


6. 每 3-4 天为细胞补加选择性培养基，直至可识别集落。


7. 挑选至少20个 Zeocin™ 抗性集落，然后扩增每个克隆以检测整合的 FRT 位点数量。分离基因组 DNA 并使用 Southern 印迹分析法区分单一整合子和多重整合子（见下文）。筛选单一整合子，然后继续下一步骤。


8. 筛选单一整合子的 β-半乳糖苷酶活性。筛选 β-半乳糖苷酶表达水平最高的克隆，用作 pcDNA6/TR 质粒的宿主。


9. 您获得稳定的 Flp-In™ 细胞系后，您可以使用该细胞系分离出通过 pcDNA6/TR 质粒表达 Tet 阻遏蛋白的稳定细胞系。备注：请记住，在含有适当量 Zeocin™ 的培养基中维持培养 Flp-In™ 宿主细胞系。

 
分离基因组 DNA

获得 Zeocin™ 抗性集落后，您将需要扩增细胞并分离基因组 DNA。您可以使用任何标准方案从细胞中分离基因组 DNA。实验方案见《现行分子生物学方案》（Ausubel 等人，1994）或《分子克隆：实验室手册》（Sambrook 等人，1989）。现有 Easy-DNA™ 试剂盒（货号 K1800-01）可用于轻松分离基因组 DNA。有关更多信息，请致电技术服务部门。
 
 
通过 Southern 印迹分析法筛选克隆

您可以使用 Southern 印迹分析法确定各 Zeocin™ 抗性克隆中整合的 FRT 位点数量。进行 Southern 印迹分析时，您应该考虑以下因素：

• 探针：我们建议您使用 lacZ 基因的片段 (100-500 bp) 作为筛选样本的探针。哺乳动物细胞不含有内源性 lacZ 基因，因此，通过 lacZ 探针应能识别含有 pFRT/lacZeo DNA 的克隆。为标记探针，我们通常使用标准随机引物试剂盒（如 Ambion、DECAprime II™ 试剂盒，货号1455）。其他随机引物试剂盒也适用。
• 限制性内切酶消化：在选择限制性内切酶用于消化基因组 DNA 时，我们建议选择能在 pFRT/lacZeo 载体中 lacZ 基因之外的单一已知位点处进行切割的酶。然后，用 lacZ 探针杂交酶消化后的 DNA，您应该能够检测到一个包含 lacZ 基因（源自 pFRT/lac）的单一条带

介绍

建立 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系后，您可以将 pcDNA5/FRT/TO 构建体和 pOG44 表达质粒共转染到宿主细胞系中，生成可诱导性表达目标基因的 Flp-In™ T-REx™ 稳定表达细胞系。将 pcDNA5/FRT/TO 构建体整合到 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞基因组中的过程发生在 FRT 位点处。pcDNA5/FRT/TO 质粒包含潮霉素抗性基因，从而能够筛选稳定细胞系（见下文）。有关 pcDNA5/FRT/TO 质粒以及将您的目标基因克隆到 pcDNA5/FRT/TO 中的更多信息，请参阅载体手册。有关 pOG44 质粒的更多信息，请见下文。
 
pcDNA5/FRT/TO 载体中的潮霉素抗性基因缺少 ATG 起始密码子和驱动该基因表达的启动子。将 pcDNA5/FRT/TO 质粒单独转染到 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系不会使含有质粒的细胞产生潮霉素抗性。只有通过由 Flp 重组酶介导的 pcDNA5/FRT/TO 质粒与 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系之间 FRT 位点重组，才可使得潮霉素抗性基因表达所需的 ATG 起始密码子和 SV40 启动子靠近并位于含该基因的框内。

 
 
如果您希望在293细胞中表达目标基因，您可以使用 Flp-In™ T-REx™-293 宿主细胞系来建立您的表达细胞系。有关更多信息，请访问我们的网站或致电技术服务部门。
 
还可以将 pcDNA5/FRT/TO 和 pOG44 共转染到 Flp-In™ 宿主细胞系中，以生成表达细胞系。Flp-In™ 宿主细胞系包含单一整合 FRT 位点，但不表达 Tet 阻遏蛋白。将 pcDNA5/FRT/TO 和 pOG44 共转染到 Flp-In™ 宿主细胞系中，可以通过 FRT 位点将 pcDNA5/FRT/TO 构建体整合到基因组中。然而，在这种情况下，pcDNA5/FRT/TO 的杂交 CMV/TetO2 启动子中的 TetO2 序列呈惰性，并且 CMV/TetO2 启动子以类似天然 CMV 启动子的水平发挥功能，从而能够组成性表达目标基因。
 
 
pOG44 质粒

将 pOG44 质粒和 pcDNA5/FRT/TO 构建体共转染到 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系中，生成可诱导表达目标蛋白的稳定细胞系。通过共转染 pOG44 和 pcDNA5/FRT/TO，能够表达 Flp 重组酶并经 FRT 位点将 pcDNA5/FRT/TO 质粒整合到基因组中。将 pcDNA5/FRT/TO 构建体整合到基因组中后，即不再需要 Flp 重组酶。因为 Flp 重组酶可能介导切割 pcDNA5/FRT/TO 构建体，其持续存在实际上对细胞有害。 pOG44 质粒缺乏用于筛选哺乳动物细胞的抗生素耐药性标记物。因此，在转染后的细胞培养并用潮霉素筛选时，质粒及随之引起的 Flp 重组酶表达将逐渐丢失。
 
 
Flp 重组酶

FLP 基因最初从酿酒酵母 2m 质粒中分离得到（Broach 等人，1982；Broach 和 Hicks，1980）。 在哺乳动物细胞中进行试验时，已证明，Flp 重组酶在约 30℃ 时重组活性最佳，在 37℃ 时的活性相对较低，该结果与其在酵母中的生理作用一致（Buchholz 等人，1996）。 pOG44 中的 FLP 基因含有点突变，编码的 Flp 重组酶在第70位的苯丙氨酸被亮氨酸替换，因此其活性进一步受限（Buchholz 等人，1996）。在 37℃ 下，与天然 Flp 重组酶相比，所得 Flp 重组酶 (flp-F70L) 在哺乳动物细胞中的不耐热性增加（Buchholz 等人，1996）。研究表明，pOG44 表达的 Flp 重组酶在 37℃ 下的活性仅为天然 Flp 重组酶的 10%（Buchholz 等人，1996）。

 
当生成 Flp-In™ T-REx™ 表达细胞系时，请务必记住，由于您想要只通过 FRT 位点在有限时间内重组和整合 pcDNA5/FRT/TO 构建体，因此您筛选的是相对罕见的重组事件。在这种情况下，使用效率很低的 Flp 重组酶有利，并可能减少其他不需要的重组事件的发生。
 
 
提醒：   通过 FRT 位点将 pcDNA5/FRT/TO 构建体整合到基因组中将导致以下事件：

• 在 SV40 早期启动子和 ATG 起始密码子（由 pFRT/lacZeo 提供）的下游插入潮霉素抗性基因
• 在lacZ-Zeocin™ 融合基因的上游插入包含 CMV/TetO2 启动子、目标基因以及 BGH 多聚腺苷酸化信号的质粒
• 由于丢失 SV40 早期启动子和 ATG 起始密码子以及插入包含 CMV/TetO2 启动子、目标基因和 BGH 多聚腺苷酸化信号的基因盒，因此功能性 lacZ-Zeocin™ 转录单元受到破坏

因此，您的 Flp-In™ T-REx™ 表达细胞系应该表现出以下表型：

• 潮霉素抗性
• Zeocin™ 敏感性
• 缺乏 β-半乳糖苷酶活性
• 杀稻瘟菌素抗性
• 四环素调节目标基因表达

阳性对照

pcDNA5/FRT/TO/CAT 质粒作为哺乳动物细胞转染和表达的阳性对照载体，可用于测定 Flp-In™ T-REx™ 表达细胞系的表达水平。如果您有多种不同的 Flp-In™

T-REx™ 宿主细胞系（包含整合于不同基因座的 FRT 位点的细胞系），您可能需要使用 pcDNA5/FRT/TO/CAT 对照载体比较不同基因座的蛋白表达水平。
有关 pcDNA5/FRT/TO/CAT 的更多信息，请参阅 pcDNA5/FRT/TO 载体手册。
 
潮霉素 B

pcDNA5/FRT/TO 载体包含大肠杆菌潮霉素抗性基因 (HPH)（Gritz 和 Davies，1983），因此可使用抗生素潮霉素 B 筛选转染子（Palmer 等人，1987）。当添加到培养的哺乳动物细胞中时，潮霉素 B 作为氨基环醇发挥作用，通过干扰易位和促进错译而抑制蛋白质合成。潮霉素 B 液体单独提供。
 

• 潮霉素 B 对光敏感。请在 +4℃ 下避光储存液体储备液。
• 潮霉素 B 有毒。请勿摄入含有该药的溶液。
• 处理潮霉素 B 和含潮霉素 B 的溶液时，请佩戴手套、穿上实验服以及佩戴防护眼镜或护目镜。

 
制备和储存潮霉素 B

赛默飞世尔科技现可供应 100 mg/mL 潮霉素 B 储备液，由潮霉素 B 溶于经高压灭菌的去离子水中并通过过滤灭菌制成。溶液为棕色。在 +4℃ 下储存时，则能保证潮霉素 B 可稳定保持6个月。含潮霉素的培养基最多可稳定保持6周。
 
潮霉素敏感性测定

为成功生成通过 pcDNA5/FRT/TO 表达您目标基因的稳定细胞系，您需要确定杀死未转染 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系所需的潮霉素 B 最低浓度。通常，10-400 mg/mL 浓度范围内的潮霉素 B 足以杀死大多数未转染的哺乳动物细胞系。我们建议您对一系列浓度（0、10、50、100、200、400、600 mg/mL 潮霉素 B）进行试验，以确保您能够确定 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系所需的最低浓度。
 
四环素

四环素（分子量 = 444.4）通常用作广谱抗生素，用于通过阻滞细菌中多肽链延伸而抑制翻译。在 Flp-In™ T-REx™ 系统中，四环素用作诱导剂，用于诱导源自 pcDNA5/FRT/TO 表达载体的目标基因转录。四环素通过与 Tet 阻遏蛋白同源二聚体结合并导致阻遏蛋白发生构象变化使其无法与 Tet 操纵子结合，从而诱导转录。四环素与 Tet 阻遏蛋白的缔合常数为 3 x 10⁹ M-1（Takahashi 等人，1991）。四环素随 Flp-In™ T-REx™ Core 试剂盒提供，但也可以单独获取。
 
备注：   用于诱导 Flp-In™ T-REx™ 系统中基因表达的四环素浓度通常不足以对哺乳动物细胞产生毒性。
 
减四环素血清

当在含有胎牛血清 (FBS) 的培养基中培养细胞时，请注意，许多批次 FBS 含有四环素，因为 FBS 通常从喂食含四环素饲料的母牛所产胎牛中分离得到。如果您在培养基含有未减少四环素含量的 FBS 情况下培养细胞，您可能在未添加四环素的情况下观察到目标基因的低水平基础表达。我们在培养基含有可能未减少四环素含量的 FBS情况下培养了哺乳动物细胞，并在未额外添加四环素的情况下观察到阳性对照载体呈现不可检出至极低水平的 CAT 基础表达。如果您的目标基因产生有毒蛋白，您可能希望使用减四环素的 FBS 培养细胞。有关更多信息，请咨询您的血清供应商。

• 四环素对光敏感。在 +4℃ 下避光储存粉状药物。在临用前制备含有四环素的培养基。
• 四环素有毒。请勿摄入或吸入粉末或含有此药的溶液。
• 处理四环素和含四环素的溶液时，请佩戴手套、穿上实验服以及佩戴防护眼镜或护目镜。

四环素制备

要制备四环素：

1. 称取 10 mg 四环素（Flp-In™ T-REx™ Core 试剂盒中提供）并转移至 15 mL 无菌聚丙烯锥形管中。


2. 将 10 mg 四环素重悬于 10 mL 的 100% 乙醇中。从而制得 1 mg/mL 四环素储备液，溶液为黄色。


3. 请在 -20℃ 下避光储存储备液。

建议

由于将 pcDNA5/FRT/TO 构建体正确整合到基因组中取决于 Flp 重组酶，细胞中的 Flp 重组酶表达水平将决定重组反应的效率。Flp 重组酶水平必须足够高，能够介导在 FRT 位点处的重组（单一重组事件）并克服该酶的低内在活性。我们调整了 pOG44 与 pcDNA5/FRT/TO 表达质粒共转染到 Flp-In™ T-REx™ 哺乳动物宿主细胞中的比例，以优化重组效率。我们建议您以至少 9:1 (w/w) 的 pOG44:pcDNA5/FRT/TO 表达质粒比例共转染 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系。请注意，该比例可能会因细胞系的性质而异。您可能要根据经验为您的细胞系确定此比例。
 
当转染 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系时，请确保使用超螺旋 pOG44 和 pcDNA5/FRT/TO 质粒 DNA。仅当 pcDNA5/FRT/TO 质粒为环状时，才会在 pcDNA5/FRT/TO 上的 FRT 位点与 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系中的整合 FRT 位点之间发生由 Flp 介导的重组。pOG44 质粒应为环状，以尽量减少质粒整合到基因组中的可能性。
 
 
筛选稳定的 Flp-In™ T-REx™ 表达细胞系

确定在 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系中用于筛选的潮霉素适当浓度后，您可生成能够诱导性表达 pcDNA5/FRT/TO 构建体的稳定细胞系。提醒：共转染后，您的 Flp-In™ T-REx™ 表达克隆应对 Zeocin™ 敏感，因此，您的筛选培养基不应含有 Zeocin™。请记住，您的筛选培养基应包含杀稻瘟菌素，以筛选 pcDNA6/TR 质粒。

1. 使用所需方案，按照 pOG44:pcDNA5/FRT/TO 质粒 DNA 为 9:1 的比例（见上文）共转染 Flp-In™ T-REx™ 哺乳动物宿主细胞。请记住，纳入一块包含未转染细胞的培养板作为阴性对照，并将 pcDNA5/FRT/TO/CAT 质粒作为阳性对照。


2. 转染后24小时，洗涤细胞并向细胞中加入新鲜培养基。


3. 转染后48小时，将细胞分流转移至新鲜培养基中。分流细胞以使细胞汇合度不超过 25%。如果细胞密度太高，抗生素将不会杀死细胞。抗生素对于分裂活跃的细胞的作用最佳。


4. 在 37℃ 下孵育细胞 2-3 小时，直至其附着在培养皿上。


5. 移除培养基，添加含有细胞系所需预定浓度的潮霉素（和杀稻瘟菌素）的新鲜培养基。


6. 每 3-4 天为细胞补加选择性培养基，直至可识别集落。


7. 挑选 5-20 个潮霉素抗性集落并扩增细胞。通过检测每一个克隆的 Zeocin™ 敏感性并确定是否缺乏 β-半乳糖苷酶活性，验证 pcDNA5/FRT/TO 构建体是否已整合到 FRT 位点中。备注：如果需要，您也可以筛选多克隆细胞群。


8. 筛选呈现潮霉素抗性、Zeocin™ 敏感性和 LacZ - 的克隆，然后转到下一页以检测四环素调节目标基因表达。

 
多克隆筛选

如果您使用单一整合子作为 Flp-In™ T-REx™ 宿主细胞系，则在 pcDNA5/FRT/TO 和 pOG44 共转染并用潮霉素筛选后，获得的所有潮霉素抗性集落都应该是同基因克隆（即在每个克隆中，pcDNA5/FRT/TO 应整合到同一个基因座中，因此，所有克隆都应该相同）。在获得同基因克隆后，您应能够进行“多克隆”筛选和筛选潮霉素抗性细胞。无需挑取和筛选表达目标蛋白的单独集落，前提是您希望如此。经潮霉素筛选后，只需将集落合并，并在整个细胞群中筛选受四环素调节的目标基因表达。
 
诱导基因表达

下文介绍了四环素诱导目标蛋白表达的指南。表达条件可能因目标蛋白的性质和细胞系而异；因此，可能需要开展一些经验性实验以确定诱导表达的最佳条件。

• 将 Flp-In™ T-REx™ 表达细胞系接种于含杀稻瘟菌素和潮霉素的培养基中。
• 为诱导目标基因表达，移除培养基，向细胞中添加含有适当浓度四环素的新鲜培养基。通常，我们建议您向细胞中加入四环素至终浓度为 1 µg/mL（每 5 mL 培养基中加入 5 µL 的 1 mg/mL 储备液），并将细胞置于 37℃ 下孵育24小时。
• 收获细胞并检测基因表达。

 
优化表达

您可能需要改变四环素的浓度 (0.1-1 µg/mL) 和暴露于四环素的时间（8-48 小时），以优化或调节细胞系的表达。
 
其他诱导剂

您可以在 Flp-In™ T-REx™ 系统中使用多西环素作为替代诱导剂。多西环素的作用机制与四环素相似，在 Flp-In™ T-REx™ 系统中具有与四环素相似的剂量效应和诱导特征。多西环素的半衰期长于四环素（分别为48小时和24小时）。多西环素可以从 Sigma （货号 D9891）购得。

介绍

Flp-In™ 细胞系可稳定表达 lacZ-Zeocin™ 融合基因，旨在与 Flp-In™ 系统（货号K6010-01 和 K6010-02）搭配使用。各细胞系都包含源自 pFRT/lacZeo 或 pFRT/lacZeo2 的单一整合 Flp 重组靶标 (FRT) 位点，并经 Southern 印迹分析确认。有关生成 Flp-In™ 细胞系的信息，请参见下文。有关 Flp-In™ 系统及其组分的更多信息，请参阅 Flp-In™ 系统手册、访问我们的网站或致电技术服务部门。也可从我们的网站下载 Flp-In™ 系统手册。
 
生成 Flp-In™ 表达细胞系需要将包含目标基因的 Flp-In™ 表达载体（如 pcDNA5/FRT 载体）和 Flp 重组酶表达质粒 pOG44 共转染到 Flp-In™ 细胞系中（O'Gorman 等人，1991）。Flp 重组酶可介导 Flp-In™ 表达构建体在整合的 FRT 位点处通过位点特异性 DNA 重组插入基因组中（O'Gorman 等人，1991；Sauer，1994）。使用潮霉素 B 进行筛选，能够生成通过 Flp-In™ 表达载体表达目标基因的稳定细胞系。有关 FRT 位点和 Flp 重组酶介导的 DNA 重组的更多信息，请参阅 Flp-In™ 系统手册。
 
 
亲本细胞系
下表简要说明了用于生成各 Flp-In™ 细胞系的亲本细胞系来源。亲本细胞系获自美国标准培养物保藏中心 (ATCC)。其中包括每个细胞系的 ATCC 编号。有关亲本细胞系的更多信息，请访问 ATCC 网站 (www.atcc.org)。

Flp-In™-293 和 Flp-In™-CV-1 细胞系

Flp-In™-293 和 Flp-In™-CV-1 细胞系包含单一整合 FRT 位点，并在 SV40 早期启动子的控制下稳定表达源自 pFRT/lacZeo 质粒的 lacZ-Zeocin™ 融合基因。虽然 FRT 位点在各 Flp-In™ 细胞系中的位置尚未经过图谱分析，但据推测已整合到有转录活性的基因座中，通过生成含 pcDNA5/FRT/CAT 对照质粒的 Flp-In™ 表达细胞系得以确定。Flp-In™ 细胞系应在含有 Zeocin™ 的培养基中维持培养。有关 pFRT/lacZeo 和 pcDNA5/FRT/CAT 的更多信息，请参阅 Flp-In™ 系统手册。

Flp-In™-CHO 细胞系

Flp-In™-CHO 细胞系含有单一整合 FRT 位点，并稳定表达源自 pFRT/lacZeo2 质粒的 lacZ-Zeocin™ 融合基因。请注意，pFRT/lacZeo2 含有一个发生突变的 SV40 早期启动子 (PSV40-D)，其活性被严重削弱。pFRT/lacZeo2 中 SV40D 早期启动子的活性大约是 pFRT/lacZeo 中野生型 SV40 早期启动子的 1/60。由于 SV40D 启动子的活性很低，我们希望通过 pFRT/lacZeo2 表达 lacZ-Zeocin™ 基因的稳定转染子应包含已整合到转录活性最高的基因座中的 FRT 位点。虽然 FRT 位点在 Flp-In™-CHO 细胞系中的位置尚未经过图谱分析，但已证明整合到具有高度转录活性的基因座中，通过生成含 pcDNA5/FRT/luc （荧光素酶表达）对照质粒的 Flp-In™ 表达细胞系得以确定。Flp-In™-CHO 细胞系应在含有 Zeocin™ 的培养基中维持培养（见下文）。有关 pFRT/lacZeo2 和 SV40D 早期启动子的更多信息，请参阅 pFRT/lacZeo2 手册。
 
细胞系的培养基
下表列出了各 Flp-In™ 细胞系维持和培养所需的推荐完全培养基、冻存培养基以及抗生素浓度。

DMEM

Dulbecco 改良 Eagle 培养基 (DMEM) 用于培养 Flp-In™-293 和 Flp-In™-CV-1 细胞系，可从赛默飞世尔科技购得（货号 11965-092）。
 
Ham’s F12

Ham’s F12 用于培养 Flp-In™-CHO 细胞系，可从赛默飞世尔科技购得（货号 11765-054）。
 

 
青霉素-链霉素

我们建议在培养基中加入 1% 青霉素-链霉素，以防止细菌污染。青霉素-链霉素可从赛默飞世尔科技购得（货号 15070-063）。
 
 
重要指南

• FBS 用于这些细胞系时不需要热灭活。
• 细胞系应在含有上述浓度 Zeocin™ 的培养基中维持培养。
• 如果以 1:5-1:10 的稀释比例分流细胞，通常会在 3-4 天内达到 80-90% 的汇合度。

 
方法：培养 Flp-In™ 细胞系
 
常规细胞操作

为成功培养和维持您的细胞，请遵循以下指南。
 

• 与细胞直接接触的所有溶液和设备都必须无菌。始终使用适当的无菌技术，并在层流罩中进行操作。
• 在开始实验之前，请确保已建立细胞系并备有一些冻存储备液。我们建议您在实验中始终使用早期传代细胞。在收到细胞后，对特定细胞系进行培养并冻存多管细胞，以确保您拥有足够的早期传代细胞用于实验。
• 转染前，细胞应处于适当的汇合度（约 60%）且细胞活力应 >90%。
• 对于细胞常规维持培养，当所有细胞系汇合度达到 80-90% 时（以 1:5-1:10 的稀释比例分流时 3-4 天）传代。
• 通过台盼蓝拒染实验确定细胞活力。对数期培养物的细胞活力应 >90%。

 
实验开始前

请确保准备好下列溶液和贡品：

• 15 mL 无菌锥形管
• 5、10 和 25 mL 无菌移液器
• 冻存管
• 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)
• 含 0.4% 台盼蓝的 PBS 溶液
• 血细胞计数器
• 组织培养级 200 mM L-谷氨酰胺
• 胎牛血清 (FBS)
• 适当的完全培养基
• 冻存培养基
• 台式离心机
• 75 cm2 培养瓶、175 cm2 培养瓶及其他适当尺寸的组织培养瓶或培养板
• 胰蛋白酶/versene (EDTA) 溶液或其他胰蛋白酶溶液

 
 
解冻细胞

以下方案旨在帮助您解冻细胞以开始进行细胞培养。所有细胞系均为管装，在 1 mL 45% 完全培养基、45% 条件完全培养基和 10% DMSO 中含有 3 x 10 ⁶ 个细胞。

1. 从液氮中取出细胞冻存管并在 37℃ 下快速解冻。
2. 在细胞即将完全解冻之前，使用 70% 乙醇对冻存管的外壁进行消毒，之后将细胞转移至含有 12 mL 完全培养基（不含 Zeocin™）的 T-75 培养瓶中。
3. 将培养瓶置于 37℃ 下孵育 2-4 小时，使细胞附着在培养瓶底部。
4. 吸去培养基，添加 12 mL 新鲜完全培养基（不含 Zeocin™）。
5. 在 37℃ 下过夜孵育细胞。
6. 第二天，吸去培养基，添加含有 Zeocin™（上述推荐浓度）的新鲜完全培养基。
7. 孵育细胞并每日检查细胞，直至细胞汇合度达到 80-90%（2-7 天）。
8. 之后传代细胞，见下文。

传代细胞

1. 当细胞达到约 80-90% 的汇合度时，移除培养瓶中的所有培养基。
2. 使用 10 mL PBS 洗涤细胞一次，去除残余的培养基和血清。血清中含有胰蛋白酶抑制剂。
3. 向单层细胞中加入 5 mL 胰蛋白酶/versene (EDTA) 溶液，并在室温下孵育 1-5 分钟直至细胞解离。在显微镜下检查细胞，确认大多数细胞都已解离。如果细胞仍处于贴壁状态，则需稍微延长孵育时间，直至大多数细胞解离。
4. 细胞解离后，用移液管快速上下吹打溶液，以打散细胞团块。
5. 添加 5 mL 完全培养基以终止胰蛋白酶化。
6. 为在 75 cm2 培养瓶中维持细胞，从步骤5所得 10 mL 细胞悬液中取 1 mL，转移至新的 75 cm2 培养瓶中，并添加 15 mL 新鲜完全培养基（含有 Zeocin™）。备注：如果您希望细胞尽快汇合，请以更低的稀释比例（即 1:4）将细胞分瓶。
7. 为扩增细胞，在三个 175 cm2 培养瓶中各加入 28 mL 新鲜完全培养基（含有 Zeocin™），然后将 2 mL 细胞悬液转移至每个培养瓶中，总体积 30 mL。
8. 将培养瓶置于 37℃、含 5% CO₂ 的加湿培养箱中孵育。
9. 根据需要重复步骤 1-10 以维持或扩增细胞。

 
制备冻存培养基

在冻存细胞之前，您需要制备冻存培养基。由于冻存培养基包含条件完全培养基，您需要记住在冷冻前从细胞中移除条件培养基并保留。条件培养基是细胞生长的培养基。要获得条件完全培养基，请执行以下步骤之一：

• 在您计划冻存前一天，从细胞中移除培养基并保留（参见下文“冻存细胞”步骤1）。用含有 Zeocin™ 的新鲜完全培养基重新给细胞补料。将条件培养基保存于 50 mL 无菌锥形离心管中，在 +4℃ 储存直至使用。
• 在即将冻存前从细胞中移除培养基并保留（参见下文“冻存细胞”步骤2）。将条件培养基转移到 50 mL 无菌锥形离心管中，并将试管置于冰上。

应在临用前新鲜制备冻存培养基。

1. 在无菌锥形离心管中，将每 1 mL 冻存培养基需要的以下试剂混合：
   新鲜完全培养基                                     0.45 mL
   条件完全培养基                            0.45 mL
   DMSO                                                                 0.10 mL
    
    
2. 将试管置于冰上。使用后丢弃剩余的冻存培养基。

 
 
冻存细胞
在实验开始前，标记冻存管并配制冻存培养基（见上文）。将冻存培养基置于冰上。

1. 在您计划冻存细胞前一天更换培养基。如有必要，移除条件培养基并保留。向细胞中加入含有适当浓度 Zeocin™ 的新鲜完全培养基。
2. 当细胞在 175 cm2 培养瓶中的汇合度达到约 80% 时，移除培养基并保留（如果需要配制冻存培养基）。使用 10 mL PBS 洗涤细胞一次。
3. 加入 5 mL 胰蛋白酶/versene (EDTA) 溶液并孵育 1-5 分钟，直至细胞解离。
4. 细胞解离后，用移液管快速上下吹打溶液，以打散细胞团块。
5. 添加 5 mL 完全培养基以终止胰蛋白酶化。细胞计数。
6. 在台式离心机中以 250 x g 离心5分钟得到细胞沉淀，然后小心地吸去培养基。
7. 在冷却的冻存培养基（45% 完全培养基、45% 条件完全培养基和 10% DMSO）中重悬细胞，细胞密度至少为 3 x 10⁶ 个细胞/mL。
8. 将冻存管放入泡沫聚苯乙烯微量离心管架中，每个管分装 1 mL 细胞。盖紧冻存管后，请在冻存管顶部放置第二个泡沫聚苯乙烯架，以提供额外的隔热保护。将冻存管转移至 -20℃ 下放置2小时。
9. 将冻存管转移至 -70℃ 或 -80℃ 冰箱中放置过夜。
10. 将冻存管转移至液氮中进行长期储存。

 
转染
 
转染方法

Flp-In™-293 细胞和 Flp-In™-CV-1 细胞使用标准方法通常易于转染，包括磷酸钙沉淀法（Chen 和 Okayama，1987；Wigler 等人，1977）、脂质体介导转染法（Felgner 等人，1989；Felgner 和 Ringold，1989）和电穿孔转染法（Chu 等人，1987；Shigekawa 和 Dower，1988）。我们通常使用磷酸钙沉淀法转染 Flp-In™-293 和 Flp-In™-CV-1 细胞。磷酸钙转染试剂盒可从赛默飞世尔科技购得（货号 K2780-01），用于哺乳动物细胞便捷转染。
 
备注：  Flp-In™-CHO 细胞使用磷酸钙沉淀法进行转染的效率不佳。我们建议使用脂质体介导转染法将含有您目标基因的 pcDNA5/FRT 构建体引入 Flp-In™-CHO 细胞中。我们通常使用赛默飞世尔科技提供的 LIPOFECTAMINE™ 2000 试剂（货号 11668-019）转染 Flp-In™-CHO 细胞。
 
 
生成稳定表达细胞系

通过共转染 Flp-In™ 表达构建体和 pOG44 质粒，可生成稳定的 Flp-In™ 表达细胞系。使用潮霉素 B 筛选稳定转染子。在转染前，您可能需要检测 Flp-In™ 细胞系对潮霉素 B 的敏感性，以更准确地确定用于筛选的潮霉素 B 浓度。下文列出了用于筛选 Flp-In™ 表达载体的推荐潮霉素 B 浓度范围。有关更多信息，请参阅 Flp-In™ 系统手册。潮霉素 B 可从赛默飞世尔科技购得。

重要说明：  共转染后，您的 Flp-In™ 表达克隆应对 Zeocin™ 敏感，因此，您的筛选培养基不应含有 Zeocin™。
 
细胞系（Flp-In™ 表达载体                   估计潮霉素 B
转染后）                                 浓度 (µg/mL)

Zeocin™

Zeocin™ 是从链霉菌属中分离出的博来霉素/腐草霉素抗生素家族的一员。该家族的抗生素是广谱抗生素，可用作强效抗菌和抗肿瘤药物。它们对细菌、真菌（包括酵母菌）、植物和哺乳动物细胞具有强烈的毒性（Baron 等人，1992；Drocourt 等人，1990；Mulsant 等人，1988；Perez 等人，1989）。

已分离出 Zeocin™ 抗性蛋白并进行了表征（Calmels 等人，1991；Drocourt 等人，1990）。这种 13.7 kDa 蛋白质是 Sh ble 基因（印度斯坦链异壁菌博来霉素基因）的产物，可结合 Zeocin™ 并抑制其 DNA 链切割活性。当真核和原核宿主细胞表达该蛋白质时会对 Zeocin™ 产生抗性。
 
 
分子量、分子式和结构

Zeocin™ 的分子式为 C60H89N21O21S3，分子量为1,535。Zeocin™ 的结构见下图。

Zeocin™ 的应用

Zeocin™ 用于哺乳动物细胞（Mulsant 等人，1988）、植物（Perez 等人，1989）、酵母菌（Baron 等人，1992）和原核生物（Drocourt 等人，1990）的筛选。通常，使用 50-1000 µg/mL 浓度范围的 Zeocin™ 进行哺乳动物细胞筛选。转染前，我们建议您首先检测哺乳动物宿主细胞对 Zeocin™ 的敏感性，因为细胞系间的天然抗性有所不同。
 
 
处理 Zeocin™

• 将 Zeocin™ 储存在 -20℃ 下，在使用前置于冰上解冻。
• Zeocin™ 对光敏感。避光储存药物、培养板和含有药物的培养基。
• 处理含有 Zeocin™ 的溶液时，请佩戴手套、穿上实验服以及佩戴防护眼镜或护目镜。
• Zeocin™ 有毒。请勿摄入或吸入含有该药物的溶液。

订购信息

Zeocin™ 可从赛默飞世尔科技购得。为方便您使用，该药物在经高压灭菌的去离子水制备而成，可提供 1.25 mL 等分试样，浓度为 100 mg/mL。如果将 Zeocin™ 储存在 -20℃ 下，则能保证 Zeocin™ 维持6个月的稳定性。

            含量                                   货号
             1克                                    R250-01
             5克                                  R250-05
 
 
杀稻瘟菌素

杀稻瘟菌素 S HCl 是从灰色链霉菌中分离得到的核苷类抗生素，可抑制原核细胞和真核细胞中的蛋白质合成（Takeuchi 等人，1958；Yamaguchi 等人，1965）。表达以下两种杀稻瘟菌素 S 脱氨酶基因中的任一种即可产生抗性：来自土曲霉的 bsd（Kimura 等人，1994）或来自蜡样芽孢杆菌的 bsr（Izumi 等人，1991）。这些脱氨酶将杀稻瘟菌素 S 转换为无毒脱氨基羟基衍生物（Izumi 等人，1991）。
 
 
分子量、分子式和结构
杀稻瘟菌素 S 的分子式为 C17H26N8O5-HCl，分子量为458.9。杀稻瘟菌素的结构见下图。




处理杀稻瘟菌素

处理杀稻瘟菌素时，请始终佩戴手套、面罩、护目镜和防护服（如实验服）。在通风柜中称量杀稻瘟菌素并制备溶液。
 
 
制备和储存储备液

可单独获取杀稻瘟菌素（货号 R210-01）50 mg 等分试样。杀稻瘟菌素可溶于水。通常使用无菌水制备 5-10 mg/mL 储备液。

• 将杀稻瘟菌素溶于无菌水中并对溶液进行过滤除菌。
• 以适合一次使用的小体积分装（参见下一要点至最后一个要点），在 -20℃ 下冻存以供长期储存或在 +4℃ 下短期储存。
• 水性储备液在 +4℃ 下可维持储存 1-2 周，在 -20℃ 下可维持储存 6-8 周。
• 水性溶液的 pH 值应为7.5，以防止杀稻瘟菌素失活。
• 储备液不得经历冻融循环（请勿储存于无霜冰箱中）。
• 解冻后按需要使用，解冻后的储备液可在 +4℃ 下储存最多2周。
• 含有杀稻瘟菌素的培养基可在 +4℃ 储存最多2周。

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