诱导型 shRNA 表达载体

BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒将 Invitrogen 的 BLOCK-iT™ RNAi 和 T-REx™ 技术相结合，可促进 H1/TO RNAi 盒中感兴趣短发夹 RNA (shRNA) 的四环素调节表达，以用于哺乳动物细胞中的 RNA 干扰 (RNAi) 分析。该试剂盒提供了一种经过 Gateway 调整的入门载体，其设计用于在分裂的哺乳动物细胞中实现 shRNA 的高效、短暂或稳定的调节表达，或将 H1/TO RNAi 盒轻松转移至其他合适的 Gateway 目的载体中，以便用于其他 RNAi 应用。有关 BLOCK-iT™ RNAi、T-REx™ 和 Gateway 技术的更多信息，请参见下文。

BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒的优势

使用 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒进行基于载体的 shRNA 表达具有以下优势：

• 可提供一种快速高效的方法，将编码所需 shRNA 靶序列的双链寡核苷酸 (ds oligo) 双链体克隆到含有 RNA 聚合酶 III (Pol III) 驱动的表达盒（即 H1/TO RNAi 盒）的入门载体中，用于 RNAi 分析。
• 含有 H1/TO RNAi 表达盒的入门构建体可以直接转染至表达 Tet 抑制子的哺乳动物细胞中，以便对 shRNA 靶序列快速进行四环素调节筛选。
• 该入门构建体包含一个 Zeocin™ 抗性标记物，可以在添加四环素后生成表达感兴趣 shRNA 的稳定细胞系。
• 该载体经过 Gateway 调整，可将 H1/TO RNAi 盒轻松转移至任何适用于其他 RNAi 应用的表达系统中（例如用于在难转染或非分裂哺乳动物细胞中稳定递送调节 shRNA 的慢病毒系统）。

BLOCK-iT™ RNAi 技术

Invitrogen 提供多种有助于在哺乳动物和无脊椎动物系统中进行 RNAi 分析的 BLOCK-iT™ RNAi 产品。BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒和 BLOCK-iT™ U6 RNAi 入门载体试剂盒（货号分别为 K4920-00 和 K4945-00）利用基于载体的方法，可高效生成用于在哺乳动物细胞中组成型或调节性表达 shRNA 分子的 RNAi 盒。提供有助于生产和递送合成短干扰 RNA (siRNA)、剪切 siRNA (d-siRNA) 或双链 RNA (dsRNA) 的其他 BLOCK-iT™ RNAi 产品，用于在哺乳动物细胞或无脊椎生物中进行 RNAi 分析（如适用）。有关任何一种 BLOCK-iT™ RNAi 产品的更多信息，请访问 RNAi 中心应用门户网站 www.lifetechnologies.com/rnai 或联系技术服务部门


T-REx™ 技术

T-REx™ 技术通过使用大肠杆菌 Tn10 编码的四环素 (Tet) 抗性操纵子中的调控元件，促进哺乳动物细胞中感兴趣基因的四环素调节表达（Hillen 和 Berens，1994；Hillen 等人，1983）。T-REx™ 系统中的四环素调节以四环素与 Tet 抑制子的结合以及控制感兴趣基因表达的启动子的去阻遏作用为基础（Yao 等人，1998）。T-REx™ 系统的主要组分包括：

• 一种诱导性表达构建体，在包含两个四环素操纵基因 2 (TetO2) 位点的杂合启动子的控制下，促进感兴趣基因的四环素调节表达。
• 一种调节性表达构建体，可促进 Tet 抑制子 (TetR) 的高水平、组成型表达。在 T-REx™ 系统中，TetR 基因的表达受 CMV 启动子的控制。
• 用于诱导表达的四环素。

当诱导性表达构建体和调节性表达构建体存在于同一哺乳动物细胞中时，在不存在四环素的情况下会抑制感兴趣基因的表达，在存在四环素的情况下会诱导其表达（Yao 等人，1998）。


Gateway 技术

Gateway 技术是一种通用的克隆方法，利用噬菌体 λ 的位点特异性重组特性 (Landy, 1989)，提供一种快速高效的方法，将您的感兴趣 DNA 序列（例如 H1/TO RNAi 盒）移入多个载体系统中。只需以下操作，即可使用 pENTR™/H1/TO 载体表达您的感兴趣 shRNA：
 

1. 将编码感兴趣 shRNA 的 ds oligo 克隆到 pENTR™/H1/TO 载体中，以生成入门克隆。


2. 从以下选项中选择一项：

• 将您的入门构建体转染至表达 Tet 抑制子 (TetR) 的哺乳动物细胞。加入四环素以瞬时检测靶基因敲低情况。
• 将入门构建体转染至表达 TetR 的哺乳动物细胞中，并使用 Zeocin™ 选择来生成稳定细胞系。加入四环素以检测靶基因敲低情况。
• 进行入门构建体与合适的 Gateway 目的载体之间的 LR 重组反应，以生成用于其他 RNAi 应用的表达克隆。

有关 Gateway 技术的更多信息，请参阅 Clonase™ II Gateway 技术手册，该手册可从我们的网站 (www.lifetechnologies.com) 上下载或致电技术服务部获取。

注：BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统也包含 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统组分和 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统手册。

试剂盒组分
 
BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒和 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统包括下列组分。有关 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒内容物的详细说明，请参见下文。有关 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 试剂内容物的详细说明，请参见 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统手册。

运输/储存

BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒和 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统按如下所述运输。接收后，请按如下所述储存每种产品。有关随试剂盒提供的 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 试剂的更多详细信息，请参阅 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统手册。

诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂和四环素
 
诱导型 H1 RNAi 入门载体和四环素盒（盒 1）包括以下试剂。将四环素避光储存在 -20°C 下。将其他试剂储存在 -20°C 下。

T4 DNA 连接酶的单位定义
 
一个 (Weiss) 单位的 T4 DNA 连接酶可于 37°C 下在 20 分钟内催化 1 nmol 32P 标记的焦磷酸盐转换为 [λ/β-32P]ATP（Weiss 等人，1968）。一个单位相当于约 300 个粘性末端连接单位。

引物序列

下表列出了试剂盒中所含引物的序列和供应量。

LacZ2.1 对照寡核苷酸序列

lacZ2.1 对照寡核苷酸的序列如下所示。lacZ2.1 对照 DNA 寡核苷酸经过退火处理，以 5 nM 双链寡核苷酸的形式在试剂盒中提供，可直接用于连接反应

One Shot TOP10 试剂

One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌试剂盒（盒 2）包括以下试剂。转化效率 > 1 x 10⁹ cfu/µg 质粒 DNA。储存在 -80°C 下。
 

流程图

下图显示了使用 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒生成 pENTR™/H1/TO 入门克隆所需的主要步骤。

介绍

如需使用 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒，您将首先需要设计两个单链 DNA 寡核苷酸；一个编码靶标 shRNA（“上游链”寡核苷酸），另一个编码其补体（“下游链”寡核苷酸）。然后，您需要对上游和下游链寡核苷酸进行退火处理，生成适用于克隆到 pENTR™/H1/TO 载体中的双链寡核苷酸 (ds oligo)。
 
单链寡核苷酸 (ss oligo) 的设计对于克隆程序和最终的 RNAi 分析的成功而言至关重要。本部分提供了一般指南，帮助您选择靶序列并设计 ss oligo。但请注意，仅遵循这些指南并不能保证 shRNA 将有效敲低靶基因。对于给定的靶基因，您可能需要生成并筛选多个 shRNA 序列，以便从中鉴别出在基因敲低研究中具有活性的一个序列。 
 
建议
 
我们建议您使用 Invitrogen 的 RNAi Designer，这是一款在线工具，可帮助您设计和订购任何感兴趣靶基因的 shRNA 序列。RNAi Designer 将本手册中提供的指南以及其他设计规则整合成一种专有算法，以根据靶序列设计可适用于克隆到 pENTR™/H1/TO 或 pENTR™/U6 载体中的 shRNA 序列。或者，如果您已经确定了一种在触发靶基因敲低方面具有活性的合成 siRNA，则 RNAi Designer 会将该 siRNA 转化为合适的 shRNA。如需使用 RNAi Designer，请参见 www.lifetechnologies.com/rnai。
 
需要考虑的因素

在设计上游和下游链单链寡核苷酸时，应考虑以下因素：
 
上游链寡核苷酸

• 帮助进行定向克隆所需的序列
• 转录起始位点
• 编码感兴趣 shRNA 的序列（即茎环序列）

下游链寡核苷酸

• 帮助进行定向克隆所需的序列
• 与上游链寡核苷酸互补的序列

有关定向克隆的序列要求的更多信息，请参见下文。有关选择靶序列、环序列和转录起始序列的指南，请参见下文。有关 ss oligo 设计的示例，请参见下文。

定向克隆所需序列

要将 ds oligo 定向克隆到 pENTR™/H1/TO 中，您必须将以下 4 个核苷酸添加至相应 ss oligo 的 5' 末端：

• 上游链寡核苷酸：将 CACC 添加至寡核苷酸的 5' 末端。CACC 与 pENTR™/H1/TO 载体中的突出端序列 GTGG 互补，构成 H1/TO 启动子的最后 4 个碱基。
• 下游链寡核苷酸：将 AAAA 添加至寡核苷酸的 5' 末端。AAAA 与 pENTR™/H1/TO 载体中的突出端序列 TTTT 互补，构成 Pol III 终止子的前 4 个碱基。

shRNA 的结构特征

提醒：在设计编码 shRNA 的上游链寡核苷酸时，请记住 shRNA 通常包含以下结构特点：

• 来自靶基因的短核苷酸序列（即靶序列），然后是
• 短环和
• 与初始靶序列反向互补的短核苷酸序列。

 
请注意，在转录时，靶序列及其互补碱基配对形成 shRNA 的茎。有关选择靶序列和环序列的指南，请参见下文。

选择靶序列

当对特定基因进行 RNAi 分析时，您选择的靶序列可能会显著影响所观察到的基因敲低程度。在选择您的靶序列时，我们建议您遵循以下指南。请注意，这些只是一般性建议，可能会出现例外情况。
 
长度： 我们建议选择长度范围为 19 至 29 个核苷酸的靶序列。较长序列可能会在哺乳动物细胞中诱导非特异性反应。

复杂性：

• 确保靶序列不包含具有三个以上相同核苷酸的运行。特别是要避免选择包含具有四个胸苷 (T) 运行的靶序列，因为此类序列将导致转录提前终止。
• 选择 GC 含量较低的序列（建议的 GC 含量为 ~30%-50%）。
• 避免选择属于 RNA-蛋白相互作用的已知位点的靶序列。

同源性：  确保靶序列与其他基因无显著同源性，因为这可能增加脱靶 RNAi 效应。 

方向：您可以选择编码靶标 mRNA 的正义序列或反义序列的靶序列。 因此，您可以从两种可能方向生成 shRNA：正义序列-环-反义序列或反义序列-环-正义序列。
 
siRNA：如果您已经确定了一种在触发靶基因敲低方面具有活性的合成 siRNA，尝试使用相同的靶序列生成 shRNA。  
 
环序列

您可以使用 4 至 11 个核苷酸范围内的任何长度的环序列，但通常首选短环（即 4-7 个核苷酸）。避免使用含有胸苷 (T) 的环序列，因为其可能会导致提前终止。当靶序列本身以一个或多个 T 核苷酸结尾时，这种情况尤为明显（参见上一页）。

注：我们已将以下环序列包括在活性的 shRNA 分子中：

• 5'-CGAA-3' 
• 5'-AACG-3' 
• 5'-GAGA-3'

shRNA 转录在 H1/TO 启动子序列结束后的第一个碱基处启动。在上游链寡核苷酸中，转录起始位点对应于为进行定向克隆而添加的四个碱基对 CACC 序列之后的第一个核苷酸。我们建议在腺苷 (A) 或鸟苷 (G) 处启动 shRNA 序列。请注意，天然 H1 RNA 的转录在 A 处启动。一般不建议在 C 或 T 处启动转录，因为这可能影响起始效率和位置。选择转录起始位点时，您还应记住以下几点：
 
在 A 处启动

• 如果 A 是靶序列的第一个碱基，您不需要将互补 T 添加到上游链寡核苷酸的 3' 末端，因为 T 将由 Pol III 终止子的第一个碱基提供。类似地，如果靶序列的前 2 个或 3 个碱基是 A，则无需将互补 T 添加到上游链寡核苷酸的 3' 末端处。有关示例，请参见以下示例 2。
• 如果 A 不是靶序列的第一个碱基，请将 A 添加到上游链寡核苷酸的 5' 末端处。由于 T 将由 Pol III 终止子的第一个碱基提供，因此您无需在上游链寡核苷酸的 3' 末端处添加互补 T。

在 G 处启动

• 如果 G 是靶序列的第一个碱基，则在上游链寡核苷酸的 3' 末端处添加互补 C。
• 如果 G 不是靶序列的第一个碱基，我们建议直接在 CACC 突出端序列后的上游链寡核苷酸的 5' 末端处添加 G。在这种情况下，不要将互补 C 添加到上游链寡核苷酸的 3' 末端处。有关示例，请参见以下示例 1。注：  我们发现在这种情况下添加互补 C 会导致 shRNA 的活性降低。

如果您计划使用 pENTR™/H1/TO 载体和 Invitrogen 的 pENTR™/U6 载体（即 BLOCK-iT™ U6 RNAi 入门载体试剂盒，货号 K4945-00）表达相同的 shRNA，我们建议在 G 处启动 shRNA 序列，因为这是 U6 启动子的首选起始位点生成在 G 处启动的 shRNA 序列，使得 shRNA 能够与 pENTR™/H1/TO 或 pENTR™U6 的克隆和表达兼容。
 
请勿在合成过程中向您的 ss oligo 中添加 5' 磷酸盐。连接所需的磷酸基存在于线性化 pENTR™/H1/TO 载体中。


示例 1：ss Oligo 设计

本示例列出了编码靶向核纤层蛋白 A/C 基因的 shRNA 的上游和下游链寡核苷酸的序列。对这些特殊的 ss oligo 进行退火，生成核纤层蛋白 ds oligo，将其克隆到 pENTR™/H1/TO 中。将由此产生的核纤层蛋白 H1/TO RNAi 盒通过 LR 重组反应转移至 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体中，以生成 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统（货号 K4925-00）中提供的 pLenti4-GW/H1/TO-laminshRNA 构建体。


 


示例 2：ss Oligo 设计

本示例列出了编码靶向 lacZ 基因的 shRNA 的上游和下游链寡核苷酸的序列。对这些特殊的 ss oligo 进行退火，生成试剂盒中提供的 lacZ2.1 ds 对照寡核苷酸。请注意，在这一 shRNA 序列中，靶序列的前 3 个碱基是 A。因此，从上游链寡核苷酸的 3' 末端处省去了 3 个相应的 T。




我们通常使用 Invitrogen 的定制引物合成服务订购未纯化的脱盐单链寡核苷酸（有关更多信息，请参见 www.invitrogen.com）生产的 ss oligo 可高效退火并提供极佳的克隆结果。然而，请注意，ss oligo 的纯度和质量可能因您使用的供应商而异。如果您使用未纯化的脱盐寡核苷酸获得的退火和克隆结果多变，您可能需要订购 HPLC 或 PAGE 纯化的寡核苷酸。
 
pENTR™/H1/TO 的克隆位点和重组区域

使用下图帮助您设计合适的 DNA 寡核苷酸，以便在退火后克隆到 pENTR™/H1/TO 中。请注意下图中的以下特点：

• pENTR™/H1/TO 载体以在核苷酸 1935 至 1936 之间线性化的形式提供。线性化载体在编码 H1/TO 启动子的最后 4 个核苷酸和 Pol III 终止子的前 4 个核苷酸的每条链上包含 4 个核苷酸突出端。请注意，退火的双链 (ds) 寡核苷酸必须在每个链上含有特定的 4 核苷酸 5' 突出端，如图所示。
• 阴影区域对应于在重组后将从入门克隆转移到 Gateway 目的载体（例如 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST）中的 DNA 序列。

注：在使用 Gateway 目的载体进行重组后，得到的表达克隆将包含一个 RNAi 盒，其中包括 H1/TO 启动子、shRNA 序列以及 Pol III 终止子。
pENTR™/H1/TO 的序列可从我们的网站下载 (www.lifetechnologies.com)，也可联系技术服务部获取。 有关 pENTR™/H1/TO 的图谱，请参见附录。

介绍

在您合成合适的单链互补 DNA 寡核苷酸后，即可对等量的各单链 DNA 寡核苷酸进行退火，以生成双链寡核苷酸 (ds oligo)。本部分提供了指南和说明。
 
单链寡核苷酸

在开始之前，请确保您已使用克隆到 pENTR™/H1/TO 载体和退火所需的合适序列合成单链寡核苷酸。有关图示，请参见下图。

• “上游链”寡核苷酸：确保该寡核苷酸在 5' 末端处包含序列 CACC。
• “下游链”寡核苷酸：确保这种寡核苷酸在 5' 末端处包含序列 AAAA，并且与上游链寡核苷酸互补。 

用于退火的 DNA 寡核苷酸量

您将对等量的上游链和下游链寡核苷酸进行退火，以生成 ds oligo。我们通常在 50 µM 的最终单链寡核苷酸浓度下进行退火反应。在低于 50 µM 的浓度下退火可显著降低效率。请注意，退火步骤的效率并非 100%；即使在 50 µM 的浓度下，也至少有一半的单链寡核苷酸仍未退火。
 
重悬寡核苷酸

如果您的单链寡核苷酸以冻干粉形式提供，请在使用前将其重悬于水中或 TE 缓冲液中，从而达到 200 µM 的最终浓度。
 
需要的材料

开始前请准备好以下材料：

• 您的“上游链”单链寡核苷酸（200 µM 水溶液或 TE 缓冲液）
• 您的“下游链”单链寡核苷酸（200 µM 水溶液或 TE 缓冲液）
• 10X 寡核苷酸退火缓冲液（随试剂盒提供，盒 1）
• 无 DNase/RNase 水（随试剂盒提供，盒 1）
• 0.5 mL 无菌微量离心管
• 95°C 水浴或加热块

按照以下程序对单链寡核苷酸进行退火，以生成 ds oligo。请注意，寡核苷酸混合物的最终浓度为 50 µM。

1. 在 0.5 mL 无菌微量离心管中，在室温下配制以下退火反应物。



试剂	用量
“上游链”DNA 寡核苷酸 (200 µM)	5 µL
“下游链”DNA 寡核苷酸 (200 µM)	5 µL
10X 寡核苷酸退火缓冲液	2 µL
无 DNase/RNase 水	8 µL
总体积	20 µL




2. 在 95°C 下孵育反应物 4 分钟。


3. 从水浴或加热块中取出含有退火反应物的试管，并置于实验室工作台上。


4. 使反应混合物冷却至室温 5-10 分钟。单链寡核苷酸将在此期间退火。


5. 将样本放入微量离心机中，并短暂离心（约 5 秒）。轻轻混匀。


6. 取出 1 µL 退火混合物，并按照稀释 ds Oligo 中的说明稀释 ds oligo。


7. 将 50 µM ds oligo 混合物的剩余部分储存在 -20° C 下。

稀释 ds Oligo

要将您的 ds oligo 克隆到 pENTR™/H1/TO 中，您必须将 50 µM 储备液稀释至 5 nM 的最终浓度（即稀释 10,000 倍）。我们通常进行两次 100 倍系列稀释，第一次使用无 DNase/RNase 水稀释，第二次使用随试剂盒提供的 1X 寡核苷酸退火缓冲液稀释。按照以下程序稀释 ds oligo。

1. 使用无 DNase/RNase 水将 50 µM ds oligo 混合物（来自退火程序，步骤 5）稀释 100 倍（即使用 99 µL 无 DNase/RNase 水稀释 1 µL 50 µM ds oligo），以获得 500 nM 的最终浓度。进行涡旋处理，以彻底混合。


2. 使用 1X 寡核苷酸退火缓冲液将 500 nM ds oligo 混合物（来自步骤 1）稀释 100 倍，如下所示，以获得 5 nM 的最终浓度。进行涡旋处理，以彻底混合。将剩余的 500 nM ds oligo 储备液储存在 -20°C 下。







3. 将 5 nM ds oligo 储备液分装并储存在 -20°C 下。

 
未稀释的 ds oligo 的浓度是工作浓度的 10,000 倍。进行稀释时，注意不要交叉污染不同的 ds oligo 储备液。记得佩戴手套并在每次操作后更换移液器吸头。
 
储存 ds Oligo

稀释 ds oligo 之后，您应该有三份退火的 ds oligo 储备液。按如下方式使用每份储备液： 

• 50 µM ds oligo（未稀释）：如果现有储备液已变性或受到交叉污染，请使用此储备液制备新的已稀释 ds oligo 储备液。
• 500 nM ds oligo（稀释 100 倍）：请使用此储备液进行凝胶分析（请参见“检查 ds Oligo 的完整性”）。
• 5 nM ds oligo（稀释 10,000 倍）：请使用此储备液进行克隆。

将三份 ds oligo 储备液储存在 -20°C 下。

使用已稀释 ds oligo 储备液（例如，稀释 100 倍或 10,000 倍的储备液）时，在冰上解冻溶液。切勿加热或让 ds oligo 溶液超过室温，因为这会导致 ds oligo 融化。稀释溶液中的寡核苷酸浓度不足以进行重新退火，而是有利于形成分子内发夹结构。这些分子内发夹结构将不会克隆到 pENTR™/H1/TO 中。 
 
如果您的已稀释 ds oligo 储备液被加热，请丢弃该 ds oligo 溶液并使用上述程序制备新的已稀释储备液。
 
注：  如果 50 µM ds oligo 溶液（未稀释的储备液）被加热，则寡核苷酸将充分浓缩，并可按照退火程序重新退火。
 
检查 ds Oligo 的完整性

如需要，您可以使用琼脂糖凝胶电泳验证退火 ds oligo 的完整性。我们建议运行一份退火 ds oligo 等份试液（5 µL 500 nM 储备液），并对其与每种起始单链寡核苷酸的等份试液进行比较（将 200 µM 储备液稀释 4000 倍，达到 500 nM 的浓度；使用 5 µL 进行凝胶分析）。确保包括合适的分子量标准品。我们通常使用如下凝胶和分子量标准品：

• 琼脂糖凝胶：4% E-Gel（Invitrogen，货号 G5000-04）
• 分子量标准品：10 bp DNA 分子量标准品（Invitrogen，货号 10821-015）

预期结果

通过琼脂糖凝胶电泳分析退火 ds oligo 反应物等份试液时，我们通常会观察到以下现象：

•一条代表已退火的 ds oligo 的可检测到的高分子量条带。
•一条代表未退火的单链寡核苷酸的可检测到的较低分子量条带。请注意，因为大量单链寡核苷酸仍未退火，所以才会检测到该条带。

有关琼脂糖凝胶分析的预期结果的示例，请参见下文。如果代表 ds oligo 的条带较弱或不可见，请参见“疑难解答”部分了解对退火反应进行疑难解答的要点。
 
ss oligo 退火的效率可能因其序列和长度而异。当通过琼脂糖凝胶电泳分析退火 ds oligo 反应物时，应评估退火效率，并通过比较高分子量条带（退火 ds oligo）与低分子条带（未退火 ds oligo）的强度，粗略估计所生成退火 ds oligo 的百分比。配制连接反应物时，您将使用此信息。
 
预期结果示例

在本实验中，使用试剂盒中提供的试剂对两种 47 bp 寡核苷酸（上游链和下游链）进行退火（50 µM 最终浓度），并按照程序生成对照 ds oligo。使用水将退火反应物稀释 100 倍，达到 500 nM 的浓度。在 4% E-Gel 上分析了稀释的 ds oligo (5 µL) 和相应的单链寡核苷酸（5 µL 500 nM 储备液）的等份试液。
 
结果： ds oligo 退火反应物显示了大小与各组分单链寡核苷酸不同的明显可检测的高分子量条带。其余的未退火 ss oligo 也可被检测到。在该反应中，我们估计退火反应的效率大于 50%。
 
注：琼脂糖凝胶是非变性型；因此，由于二级结构的形成，单链寡核苷酸不能按照预期大小进行分离。

• 随试剂盒提供的 T4 DNA 连接酶和 5X 连接缓冲液经过优化，可在室温下在 5 分钟内将 ds oligo 连接到 pENTR™/H1/TO 载体中。T4 DNA 连接酶制备液和其他生产商提供的反应缓冲液可能不适用于该应用。

• 注： BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 试剂盒中提供的 T4 DNA 连接酶和反应缓冲液可从 Invitrogen 单独购买（货号 15224-017）。

• •传统的连接反应在 16°C 下过夜进行。对于此应用不建议使用此条件。遵循以下连接程序。

• 如果您的 ss Oligo 已高效退火（即，琼脂糖凝胶上较高分子量条带的强度大于较低分子量条带的强度），则在连接反应中使用 1-2 µL 的 5 nM ds oligo 储备液。
• 如果您的 ss Oligo 退火效率较低（即，琼脂糖凝胶上较高分子量的条带强度与较低分子量条带的强度相当或更低），然后将连接反应中的 5 nM ds oligo 储备液用量从 1 µL 增加至 5 µL。

• 感兴趣双链寡核苷酸（5 nM，溶于 1X 寡核苷酸退火缓冲液；使用前在冰上解冻）
• pENTR™/H1/TO，线性化（0.5 ng/µL，随试剂盒提供，盒 1；使用前在冰上解冻）
• lacZ2.1 ds 对照寡核苷酸（如需要；5 nM，溶于 1X 寡核苷酸退火缓冲液；使用前在冰上解冻）
• 5X 连接缓冲液（随试剂盒提供，盒 1）
• 无 DNase/RNase 水（随试剂盒提供，盒 1）
• T4 DNA 连接酶（1 U/µL，随试剂盒提供，盒 1）

• 注：存在 PEG 和甘油（来自连接缓冲液和 T4 DNA 连接酶）会使反应混合物具有黏性。确保通过上下吹吸来充分混匀反应物。请勿进行涡旋处理。

• 注：孵育时间可延长至 2 小时，这样可能会使菌落得率较高。

• 注： 您可将连接反应物过夜储存在 -20°C 下。

• 连接反应物（来自步骤 3）
• One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌（随试剂盒提供，盒 2；每次转化使用 1 小瓶；临使用前在冰上解冻）
• S.O.C.培养基（随试剂盒提供，盒 2；预热至室温）
• pUC19 阳性对照（随试剂盒提供，盒 2；如需要）
• 42°C 水浴
• 含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 平板（每次转化需要两个；使用前在 37°C 下预热 30 分钟） 替代产品：如需要，您可以使用含有 50 µg/mL Zeocin™ 的低盐 LB 平板对转化体进行选择。请注意，为使 Zeocin™ 具有活性，细菌培养基的盐浓度必须< 90 mM，pH 值必须为 7.5。
  

• 含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板（如果转化 pUC19 对照）
• 37°C 振摇培养箱和非振摇培养箱

1. 将 2 µL 连接反应物（来自步骤 3）加入到一小瓶 One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌中，并轻轻混匀。请勿通过上下吹吸混匀。


2. 在冰上孵育 5 至 30 分钟。

注：更长的孵育时间似乎对转化效率仅有极轻微影响。孵育时长由用户自行决定。

3. 在 42°C 下热激细胞 30 秒，请勿振摇。


4. 立即将试管转移至冰上。


5. 加入 250 µL 室温 S.O.C.培养基。


6. 将试管盖紧，并在 37°C 下水平振摇 (200 rpm) 试管 1 小时。


7. 取 40-200 µL 各转化物涂布于预热的选择性平板上并于 37°C 下孵育过夜。建议使用两种不同的体积进行铺板，确保至少有一个平板产生间隔合适的菌落。如果您正在转化 pUC19 对照，则在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的预热 LB 平板上使用 20-100 µL 转化反应物进行铺板。


8. 高效的连接反应可产生数百个集落。挑选 5-10 个集落进行分析（参见分析转化体）。

1. 挑选 5-10 个卡那霉素抗性集落，在含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 或 SOB 培养基或含有 50 µg/mL Zeocin™ 的低盐 LB 培养基中培养过夜。


2. 使用您选择的方法分离质粒 DNA。要获得用于自动或手动测序的纯质粒 DNA，我们建议使用 Invitrogen 提供的 PureLink™ HQ 小提质粒纯化试剂盒（货号 K2100-01）或 S.N.A.P.™ 中提试剂盒（货号 K1910-01）。


3. 对每种 pENTR™/H1/TO 入门构建体进行测序（请参见下文）以确认以下内容：

• ds oligo 插入片段是否存在、方向是否正确。
• ds oligo 插入片段的序列。

• 注： 由于 ds oligo 插入片段的尺寸较小，因此我们不建议使用限制性内切酶分析筛选转化体。

• 注：  包含突变的 ds oligo 插入片段的入门克隆通常会在哺乳动物细胞中引发不良 RNAi 反应。鉴别出具有正确 ds oligo 序列的入门克隆，并将这些克隆用于 RNAi 分析。

• 使用高质量的纯化质粒 DNA 进行测序。我们建议使用 Invitrogen 的 PureLink HQ 小提质粒纯化试剂盒（货号 K2100-01）或 S.N.A.P.™ 中提试剂盒（货号 K1910-01）制备 DNA。
• 向测序反应中加入 DMSO，使得最终浓度为 5%。
• 增加反应中的模板用量（最高可达正常浓度的两倍）。
• 标准测序试剂盒通常使用 dITP 取代 dGTP 以降低 G:C 压缩。其他含 dGTP 的试剂盒可用于对富含 G 和富含 GT 的模板进行测序。如果您正在使用的是含 dITP 的标准商业测序试剂盒，请获取含 dGTP 的测序试剂盒（例如，dGTP BigDye Terminator v3.0 即用型反应液循环测序试剂盒，Applied Biosystems，货号 4390229），并在测序反应中使用 7:1 的 dITP:dGTP 摩尔比。

1. 在含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 平板或含 50 µg/mL Zeocin™ 的低盐 LB 平板上，对单个集落的原始集落进行划线培养。


2. 分离单个集落，并接种至 1-2 mL 含有 50 µg/mL 卡那霉素的 LB 平板或含有 50 µg/mL Zeocin™ 的低盐 LB 平板中。


3. 使集落生长直至培养物达到固定相。


4. 将 0.85 mL 培养物与 0.15 mL 无菌甘油混合，然后转移至冻存管。


5. 将甘油储备液储存在 -80°C 下。

介绍

生成 pENTR™/H1/TO 入门构建体后，即可表达感兴趣 shRNA，对靶基因进行 RNAi 分析。本部分提供了有助于您设计转染和 RNAi 实验的一般指南。我们建议您在开始之前通读本部分。
 
影响基因敲低水平的因素

在 RNAi 实验中，很多因素都会对感兴趣基因表达的下调（即基因敲低）程度产生影响，包括：

• 转染效率
• 感兴趣基因转录速率
• 靶蛋白稳定性
• 哺乳动物细胞系生长特性
• 感兴趣 shRNA 的有效性

在设计 RNAi 实验时考虑这些因素。
 
shRNA 表达选项

有多种选项可供选择，表达用于 RNAi 分析的所选哺乳动物细胞系中的感兴趣 shRNA。选择最适合您需求的选项。

Tet 抑制子 (TetR) 表达

因为 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 系统中四环素调节的 shRNA 表达基于抑制/去抑制机制进行，所以宿主细胞系中表达的 Tet 抑制子的量将决定 pENTR™/H1/TO 构建体中 Tet 操纵基因序列的转录抑制水平。需要有足够高的 Tet 抑制子水平方可适当抑制 shRNA 的基础水平转录，进而抑制非诱导细胞中的靶基因敲低。此外，如果在引入 pENTR™/H1/TO 构建体之前哺乳动物细胞中已存在 Tet 抑制子，则可最有效地抑制基础 shRNA 表达。

由于这些原因，我们建议首先生成表达 Tet 抑制子的稳定细胞系，然后使用该细胞系作为 pENTR™/H1/TO 入门构建体的宿主（选项 2）或其他适当的诱导性表达构建体（上文的选项 3）。 如果您想实现以下目的，则特别推荐该选项：

• 在相同的哺乳动物细胞系中采用数种 shRNA 表达构建体进行调节的 RNAi 敲低实验。
• 获得最低水平的基础 shRNA 表达（即在不存在四环素的情况下实现最低水平的靶基因敲低）

要从 Invitrogen 获得表达 TetR 的稳定细胞系，请参见下面的建议。有关生成表达 TetR 的稳定细胞系的指南，请参见生成表达 TetR 的宿主细胞系。

Invitrogen 提供几种稳定表达 Tet 抑制子的 T-REx™ 细胞系。 如果您希望在 293、HeLa、CHO 或 Jurkat 细胞中检测您的感兴趣基因的四环素调节表达，您可能希望使用其中一种 T-REx™ 细胞系作为您的 pENTR™/H1/TO 入门构建体的宿主。
 
注：T-REx™ 细胞系可通过 pcDNA™6/TR 表达质粒稳定表达 Tet 抑制子。使用该质粒在 Invitrogen 的 T-REx™ 系统中生成稳定的表达 TetR 的细胞系。pLenti6/TR 和 pcDNA™6/TR 均包含相同的 TetR 基因。有关 T-REx™ 细胞系或 pcDNA™6/TR 的更多信息，请访问我们的网站 (www.invitrogen.com) 或联系技术服务部。

转染方法
对于已建立的细胞系（例如 COS、A549），请查阅原始参考文献或咨询您的细胞系的供应商，以获取最佳转染方法。应特别注意培养基要求、何时进行细胞传代以及在什么稀释条件下对细胞进行稀释分瓶。更多信息见当前分子生物学方案（Ausubel 等人，1994）。
 
转染方法包括磷酸钙（Chen 和 Okayama，1987；Wigler 等人，1977）、脂质介导（Felgner 等人，1989；Felgner 和 Ringold，1989）和电穿孔（Chu 等人，1987；Shigekawa 和 Dower，1988）。选择可在哺乳动物细胞系中实现较高效率转染的方法和试剂。有关建议，请参见下文。
 
为在多种哺乳动物细胞系中实现高效转染，我们建议使用由 Invitrogen 提供的基于阳离子脂质的 Lipofectamine™ 2000 试剂（货号 11668-027）（Ciccarone 等人，1999）。使用 Lipofectamine™ 2000 将质粒 DNA 转染至真核细胞中具有以下优势：

• 在许多哺乳动物细胞类型中都能获得极高的转染效率。
• DNA-Lipofectamine™ 2000 复合物可在存在血清的情况下直接添加到培养基中的细胞中。
• 转染后无需去除复合物、更换培养基或添加培养基，不过，4-6 小时后可以在不影响活性的情况下去除复合物。

有关 Lipofectamine™ 2000 试剂的更多信息，请参阅我们的网站 (www.lifetechnologies.com) 或致电技术服务部

shRNA 的瞬时和稳定表达

在设计 RNAi 实验时，您应考虑如何检测靶基因的敲低情况。将 pENTR™/H1/TO 构建体转染至表达 TetR 的哺乳动物细胞中后，您可以：

• 将异质细胞群合并，并在用四环素诱导后检测靶基因敲低情况（即瞬时敲低）。我们建议在诱导后至少等待 24-48 小时，再检测靶基因敲低情况，以便留出时间表达和处理 shRNA。
• 使用 Zeocin™ 对稳定转染的细胞进行选择。选择需要在转染后至少 10-14 天进行，但允许生成稳定表达感兴趣 shRNA 的克隆细胞系。shRNA 表达将受四环素调节。有关 Zeocin™ 选择的更多信息，请参阅生成稳定细胞系。

四环素

(MW = 444.4) 通常用作广谱抗生素，通过阻断细菌中的多肽链延伸来抑制翻译。在 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 系统中，四环素可作为诱导剂用于调节 H1/TO RNAi 盒中感兴趣 shRNA 的转录。四环素随 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 试剂盒提供，为即用型的 10 mg/mL 储备液，但也可以粉末形式从 Invitrogen 单独购买（货号 Q100-19）。

使用四环素

为了诱导哺乳动物细胞中感兴趣 shRNA 的转录，我们通常在完全生长培养基中添加四环素，使最终浓度达到 1 µg/mL。如需要，您可以改变用于诱导的四环素浓度（范围为 0.001 至 1 μg/mL），以调节感兴趣 shRNA 的表达。
 
注：在 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 系统中，用于诱导的四环素浓度通常不足以对哺乳动物细胞产生毒性。
 
处理四环素时，请遵循以下指南。

• 四环素对光敏感。将储备液避光储存在 -20°C 下。含有四环素的培养基须现用现配。
• 四环素有毒。请勿摄入含该药物的溶液。在处理粉末状药物时，请勿吸入。
• 在处理四环素和含四环素溶液时，请佩戴手套、穿实验服并佩戴防护眼镜或护目镜。

胎牛血清中的四环素

当在含胎牛血清 (FBS) 的培养基中培养细胞时，请注意，许多批次的 FBS 含有四环素，因为 FBS 通常是从饲喂含四环素饲料的牛中分离出来的。如果您在含未减少四环素的 FBS 的培养基中培养哺乳动物细胞，在不存在四环素的情况下，您可能会观察到感兴趣 shRNA 的一些基础表达。我们通常在含可能未减少四环素的 FBS 的培养基中培养哺乳动物细胞，并且在不存在四环素的情况下观察到 shRNA 的基础表达较低（通过靶基因敲低 % 进行测定）。根据您的应用（例如，如果靶向涉及细胞活力的蛋白），您可能希望在经过四环素检测的 FBS 中培养细胞。您可以从 Invitrogen 获得经过四环素检测的 GIBCO FBS。

介绍

本部分提供了将 pENTR™/H1/TO 构建体转染至表达 TetR 的感兴趣哺乳动物细胞系中以进行瞬时、调节性 RNAi 分析的一般指南。进行瞬时 RNAi 分析有助于：

• 快速检测特定靶基因的多个 shRNA 序列
• 快速筛选哺乳动物细胞系中的 RNAi 反应

如果您想生成表达感兴趣 shRNA 的稳定细胞系，请参见下一部分。
 
提醒：  为了获得最佳结果，我们建议您将 pENTR™/H1/TO 构建体转染至稳定表达高水平 Tet 抑制子的哺乳动物细胞系中（即，使用 Invitrogen 的 T-REx™ 细胞系之一或您生成的细胞系）。如果您尚未生成稳定的表达 TetR 的细胞系，您可以将 pENTR™/H1/TO 质粒与合适的 TetR 表达质粒（即 pcDNA™6/TR 或 pLenti6/TR）共转染至哺乳动物细胞系中。如果您希望使用这种方法，我们建议在共转染中使用的 TetR 表达质粒 DNA 是 pENTR™/H1/TO 质粒 DNA 的 6 倍。例如，当转染铺板于 24 孔板中的细胞时，使用 600 ng pcDNA™6/TR 质粒和 100 ng pENTR™/H1/TO 入门构建体 DNA。请注意，您可能需要改变用于转染的 TetR 表达质粒:pENTR™/H1/TO 的比例，借此优化抑制和诱导性。
 
质粒制备

获得入门克隆后，您必须分离质粒 DNA 进行转染。转染至真核细胞中的质粒 DNA 必须非常干净，无苯酚或氯化钠污染。污染物会杀死细胞，盐会干扰脂质络合，降低转染效率。我们建议使用 PureLink™ HQ 小提质粒纯化试剂盒（货号 K2100-01）、S.N.A.P.™ 中提试剂盒（货号 K1910-01）或 CsCl 梯度离心分离质粒 DNA。
 
阳性对照

如果您已进行了阳性对照反应，并已将随试剂盒提供的 lacZ2.1 ds oligo 克隆至 pENTR™/H1/TO 中，我们建议使用得到的 pENTR™-GW/H1/TO-lacZ2.1shRNA 入门构建体作为阳性对照，以评估细胞系中的 RNAi 反应。只需将 pENTR™-GW/H1/TO-lacZ2.1shRNA 入门构建体和随试剂盒提供的 pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 报告基因质粒共转染至表达 TetR 的哺乳动物细胞中，并使用 Western 印迹分析或活性检测方法检测转染后 48 小时 β-半乳糖苷酶表达的敲低情况。有关 pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 报告基因质粒、转染建议和 β-半乳糖苷酶活性检测方法的更多信息，请参见下文。

pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 报告基因质粒

pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 报告基因质粒随试剂盒提供，用作检测哺乳动物细胞系中的 RNAi 反应的阳性对照。在该载体中，ß-半乳糖苷酶在人巨细胞病毒 (CMV) 启动子的控制下表达为 C 端标签融合蛋白。
 
pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 载体以 10 µg 质粒 DNA 形式提供，以冻干形式溶于 TE 缓冲液（pH 值 8.0）。使用该载体时，将其重悬于 10 µL 无菌水中，以获得 1 µg/µL 储备液。必要时稀释储备液用于转染（参见下文）。  如果您希望增殖质粒，则转化 recA、endA 大肠杆菌菌株，如 TOP10。使用 10 ng 质粒进行转化，并在含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上进行选择。

转染含 LacZ 试剂

使用 lacZ 对照试剂进行 RNAi 分析时，您可以将 pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 报告基因质粒和您生成的 pENTR™-GW/H1/TO-lacZ2.1shRNA 入门构建体共转染至表达 TetR 的哺乳动物细胞系中。为了获得最佳结果，我们建议在共转染中使用的入门构建体是报告基因质粒 DNA 的 6 倍。例如，当转染铺板于 24 孔板中的细胞时，使用 600 ng pENTR™-GW/H1/TO-lacZ2.1shRNA DNA 和 100 ng pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ DNA。
 
需要的材料

开始前请准备好以下材料：

• 表达 TetR 的感兴趣哺乳动物细胞系（开始前确保细胞健康且存活率 > 90%）  注： 如果您的细胞系通过 pcDNA™6/TR 或 pLenti6/TR 表达 TetR，则将细胞维持在含有适当浓度杀稻瘟菌素的培养基中。
• pENTR™/H1/TO 入门构建体
• pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 质粒（如果进行阳性对照转染；随试剂盒提供，盒 1，在水中重悬至浓度为 1 µg/µL）
• pENTR™-GW/H1/TO-lacZ2.1shRNA 质粒（如果您已进行阳性对照连接反应并正在进行阳性对照转染）
• 所选转染试剂（例如 Lipofectamine™ 2000）
• 四环素（随试剂盒提供，盒 1；10 mg/mL 储备液）
• 适当的组织培养皿和用品

下文提供了将 pENTR™/H1/TO 入门构建体转染至表达 TetR 的所选哺乳动物细胞系中并用四环素诱导感兴趣 shRNA 的表达的指南。
 

1. 在转染前一天，以您正在使用的转染试剂的生产商建议的密度对细胞进行铺板。


2. 在转染当天（第 1 天），按照转染试剂生产商的建议，将 pENTR™/H1/TO 构建体转染至细胞中。如果您正在共转染 pENTR™/H1/TO 构建体和 TetR 表达质粒或 pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 和 pENTR™-GW/H1/TO-lacZ2.1shRNA 质粒，请按照建议使用适量的每种质粒。


3. 在转染后的适当时间（通常为 3 至 24 小时），去除培养基并更换为含 1 µg/mL 四环素的新鲜生长培养基，以诱导 shRNA 表达。请注意下列事项：
   • 如果您使用 Lipofectamine™ 2000 转染细胞，您可以早在转染后 3 小时添加四环素以诱导 shRNA 表达。
   • 如果您的实验中包含 lacZ 阳性对照质粒，请在转染后 3 小时向细胞中添加四环素。这会诱导 lacZ2.1 shRNA 的表达并防止 ß-半乳糖苷酶的蓄积，使 lacZ 敲低的可检出测量成为可能，否则其可能被 ß-半乳糖苷酶的长半衰期掩蔽。
   • 如果您使用另一种转染试剂转染细胞，您可能需要更换培养基，并让细胞在诱导前恢复 24 小时。




4. 在含有四环素的培养基中孵育细胞 24 至 96 小时（如适用），然后检测靶基因敲低情况。

 
检测 ß-半乳糖苷酶的表达情况

如果您使用含 lacZ2.1 ds oligo 的对照入门克隆（即 pENTR™-GW/H1/TO-lacZ2.1shRNA）进行 RNAi 分析，您可以使用无细胞的裂解物，通过 Western 印迹分析或活性检测方法检测 ß-半乳糖苷酶的表达和敲低情况 (Miller, 1972)。Invitrogen 提供 ß-gal 抗血清（货号 R901-25）、ß-Gal 检测试剂盒（货号 K1455-01）和 FluoReporter lacZ/半乳糖苷酶定量测定试剂盒（货号 F-2905），用于检测 ß-半乳糖苷酶的表达情况。有关 ß-半乳糖苷酶敲低实验所得结果的示例，请参见下文。

注：pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 对照质粒表达的 ß-半乳糖苷酶蛋白被融合至 V5 抗原决定簇，大小约为 119 kDa。如果您正在进行 Western 印迹分析，您也可以使用 Invitrogen 公司提供的抗 V5 抗体（例如抗-V5-HRP 抗体，货号 R961-25；或抗-V5-AP 抗体，货号 R962-25）。有关更多信息，请参阅我们的网站 (www.invitrogen.com) 或致电技术服务部。

预期结果示例：lacZ 报告基因的瞬时、调节性敲低

在本实验中，按照建议方案并使用 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒中提供的试剂生成了含有编码 shRNA（靶向 lacZ（即 pENTR™-GW/H1/TO-lacZ2.1shRNA）报告基因或内源性核纤层蛋白（即 pENTR™-GW/H1/TO-laminshRNA）基因）的 ds oligo 的 pENTR™/H1/TO 入门构建体。请注意，本实验中使用的 lacZ ds oligo 与随试剂盒提供的 lacZ2.1 ds 对照寡核苷酸相同。
 
T-REx™-293 细胞（Invitrogen，货号 R710-07）生长至汇合度达到 90%。使用 Lipofectamine™ 2000 试剂与 700 ng 质粒 DNA（100 ng pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 报告基因质粒和 600 ng 非特异性质粒 DNA）转染 24 孔板中的各孔。在一些孔中，使用 600 ng pENTR™-GW/H1/TO-lacZ2.1shRNA 或 pENTR™-GW/H1/TO-laminshRNA 构建体共转染报告基因质粒。在转染后三小时，将培养基更换为含 1 µg/mL 四环素的培养基。在诱导后 48 小时制备细胞裂解物，并检测 ß-半乳糖苷酶活性。
 
结果： 用四环素处理细胞后，源自 lacZ 的 shRNA 对 β-半乳糖苷酶活性具有明显的强效特异性抑制作用，但源自核纤层蛋白的 shRNA 对 β-半乳糖苷酶活性的抑制作用不明显。
 
注：在本实验中，源自 lacZ 的 shRNA 出现了一些基础表达，在不存在四环素的情况下培养的细胞中对 ß-半乳糖苷酶活性产生了约 15% 的抑制作用可证明这一点。

• 大小大幅增加（与巨细胞病毒感染允许细胞的影响相似）
• 细胞形状异常
• 细胞质中存在大的空囊泡（内质网和高尔基体或支架蛋白分解）
• 细胞膜和核膜破裂（这些膜中出现许多孔）
• 最终，这些“细胞”将完全分解，仅保留“一串串”蛋白。

• 表达 TetR 的感兴趣哺乳动物细胞系（开始前确保细胞健康且存活率 > 90%）  注： 如果您的细胞系通过 pcDNA™6/TR 或 pLenti6/TR 表达 TetR，则将细胞维持在含有适当浓度杀稻瘟菌素的培养基中。
• pENTR™/H1/TO 入门构建体
• 所选转染试剂（例如 Lipofectamine™ 2000）
• Zeocin™（100 mg/mL，溶于无菌水中）
• 含杀稻瘟菌素（用于维持 pcDNA™6/TR 或 pLenti6/TR 构建体）的表达 TetR 的细胞系
• 四环素（随试剂盒提供，盒 1；10 mg/mL 储备液）
• 适当的组织培养皿和用品

1. 在转染前一天，以您正在使用的转染试剂的生产商建议的密度对细胞进行铺板。


2. 在转染当天（第 1 天），按照转染试剂生产商的建议，将 pENTR™/H1/TO 构建体转染至细胞中。


3. 在转染后 4 至 6 小时，去除培养基并更换为新鲜生长培养基。在 37°C 下过夜孵育细胞。


4. 次日（第 2 天），对细胞进行胰蛋白酶化处理，并将细胞重新铺到更大尺寸的组织培养容器中含有适当浓度杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 的新鲜完全培养基中。注：在表达 TetR 的细胞系中，需要杀稻瘟菌素来维持 pcDNA™6/TR 或 pLenti6/TR 构建体。示例：如果在 6 孔板中转染细胞，则对细胞进行胰蛋白酶化处理，并将细胞重新铺到 10 cm 组织培养板中含有杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 的培养基中。


5. 每 3-4 天将培养基更换为含有杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 的新鲜培养基，直至可鉴定杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性集落（通常在选择后 10-14 天）。


6. 至少挑选 10 个杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性集落并扩增每个克隆。


7. 添加四环素，使得最终浓度为 1 µg/mL，从而诱导感兴趣 shRNA 的表达。在检测靶基因敲低情况之前，等待一段适当的时间（例如 24-48 小时）。与非诱导细胞进行比较。

• 将感兴趣调节 shRNA 递送至“难转染”或非分裂哺乳动物细胞中。使用 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体（参见下方的注释）。
• 使用除 Zeocin™ 以外的选择标记生成表达调节 shRNA 的稳定细胞系。使用包含新霉素选择标记的 pBLOCK-iT™3-DEST 载体（货号 V486-20）。

• 含 attL 的超螺旋 pENTR™/H1/TO 入门克隆
• 含 attR 的超螺旋目的载体

• 您的 pENTR™/H1/TO 入门克隆的纯化质粒 DNA（50-150 ng/µL，溶于 TE 缓冲液，pH 值 8.0）
• 所选目的载体（150 ng/µL，溶于 TE 缓冲液（pH 值 8.0））
• LR Clonase™ II 酶混合物（Invitrogen，货号 11791-020）
• TE 缓冲液（pH 值 8.0）（10 mM Tris-HCl，pH 值 8.0、1 mM EDTA）
• 2 µg/µL 蛋白酶 K 溶液（随 LR Clonase™ II 酶混合物提供）
• 用于表达的适当的化学感受态大肠杆菌宿主和生长培养基
• S.O.C.培养基
• 适当的选择性平板

介绍

利用此部分信息解决退火、克隆、转化和转染程序中遇到的问题。
 
退火反应

下表列举了进行退火反应疑难解答时，一些潜在的问题及可能的解决方案。

连接和转化反应

下表列举了进行连接和转化程序疑难解答时，一些潜在的问题及可能的解决方案。

瞬时转染和 RNAi 分析

下表列举了进行瞬时转染和敲低实验疑难解答时，一些潜在的问题及可能的解决方案。

pENTR™/H1/TO 图谱

该载体的完整核苷酸序列可从 www.invitrogen.com 下载或联系技术服务部获取。

pENTR™/H1/TO 的特点
 
pENTR™/H1/TO (3869 bp) 包含以下元件。已针对所有特点进行了功能检测，并对载体进行了完全测序。

1. 为获得 1 升溶液，将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g NaCl 溶于 950 mL 去离子水中。


2. 使用 NaOH 将溶液的 pH 值调整至 7.0，并使体积达到 1 升。


3. 在液体循环时进行 20 分钟高压灭菌。可将溶液冷却至约 55°C 并添加抗生素（如需要）。


4. 储存在 +4°C 下。

1. 为获得 1 升溶液，将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 5 g NaCl 溶于 950 mL 去离子水中。


2. 使用 NaOH 将溶液的 pH 值调整至 7.5，并使体积达到 1 升。如果制备平板，则添加 15 g/L 琼脂。


3. 在液体循环时进行 20 分钟高压灭菌。可将溶液冷却至约 55°C，并添加 Zeocin™，使得最终浓度为 50 µg/mL。如果制备平板，则倒入 10 cm 平板中。


4. 储存在 +4°C 下。含有 Zeocin™ 的平板可在 +4°C 下储存长达 2 周。

1. 称取 10 mg 四环素并转移至无菌微量离心管中。


2. 将四环素重悬于 1 mL 无菌水中，制备 10 mg/mL 黄色储备液。


3. 用箔包裹试管，并在 -20°C 下避光储存储备液。

• 将 pcDNA™6/TR 质粒（即来自 T-REx™ 系统的 TetR 表达质粒）转染至感兴趣的哺乳动物细胞中。使用杀稻瘟菌素对稳定细胞系进行选择。
• 将 pLenti6/TR 质粒（即来自 ViraPower™ T-REx™ 和 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统的 TetR 表达质粒）转染至感兴趣的哺乳动物细胞中。或者，生成 Lenti6/TR 慢病毒储备液，并使用该储备液转导感兴趣的哺乳动物细胞。使用杀稻瘟菌素对稳定细胞系进行选择。

• 将细胞系维持在含杀稻瘟菌素的培养基中
• 请记住冷冻并储存早期传代细胞小瓶 

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