介绍

介绍

BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统将 Invitrogen 的 BLOCK-iT™ RNAi 和 ViraPower™ T-REx™ 慢病毒技术结合在一起，有助于创建一种无复制能力的慢病毒，该病毒可将感兴趣诱导型短发夹 RNA (shRNA) 递送至分裂或非分裂哺乳动物细胞，以进行 RNA 干扰 (RNAi) 分析。该系统包括：

  • BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒，用于生成入门克隆，其中包含用于编码哺乳动物细胞中感兴趣 shRNA 的双链寡核苷酸 (ds oligo) 的四环素调节表达所需的元件（即人 H1/TO 启动子和 RNA 聚合酶 III (Pol III) 终止子）。包含这种 H1/TO RNAi 盒（H1/TO 启动子 + ds oligo + Pol III 终止子）的入门载体用于使用 Gateway 技术将 H1/TO RNAi 盒转移到慢病毒表达质粒中（见下文）。
  • 无启动子 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 目的载体，感兴趣 H1/TO RNAi 盒被转移至该载体中。该表达质粒包含可将构建体包装到病毒体中并可使用 Zeocin™ 抗性标记物选择稳定转导细胞系的元件。
  • pLenti6/TR 载体，可组成型表达高水平四环素 (Tet) 抑制子。该表达质粒包含可将构建体包装到病毒体中并可使用杀稻瘟菌素抗性标记物选择稳定转导细胞系的元件。
  • ViraPower™ T-REx™ 慢病毒系统的组分，用于生成在分裂和非分裂哺乳动物细胞中瞬时或稳定表达感兴趣 shRNA（四环素诱导后）或 Tet 抑制子的无复制能力的慢病毒。


BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统的优势

使用 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统有助于利用慢病毒将调节的 shRNA 递送至哺乳动物细胞，使用此系统具有下列优势：

  • pENTR™/H1/TO 入门载体可提供一种快速高效的方法，将编码所需 shRNA 靶标序列的 ds oligo 双链体体克隆到含有 RNA Pol III 依赖性、四环素调节表达盒（即 H1/TO RNAi 盒）的载体中，用于 RNAi 分析。
  • 系统中的载体经过 Gateway 调整，可轻松将 H1/TO RNAi 盒从 pENTR™/H1/TO 载体转移到 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体中。
  • 生成一种可高效转导分裂和非分裂哺乳动物细胞的无复制能力的慢病毒，从而拓宽潜在 RNAi 应用范围，超越其他传统逆转录病毒系统 (Naldini, 1998)。
  • 在培养物中或体内将感兴趣 shRNA 或 Tet 抑制子高效递送至哺乳动物细胞。可通过四环素调节感兴趣 shRNA 的表达。
  • 包括可表达 Tet 抑制子的慢病毒构建体，有助于生成可快速筛选多个表达构建体的表达 TetR 的稳定细胞系。
  • 与传统腺病毒系统相比，可实现更稳定且长期的感兴趣 shRNA 表达。
  • 生成宿主范围更广的假病毒 (Yee, 1999)。
  • 包括多种设计用于提高系统生物安全性的特点。


BLOCK-iT™ RNAi 技术

Invitrogen 提供大量有助于在哺乳动物和无脊椎动物系统中进行 RNAi 分析的 BLOCK-iT™ RNAi 产品。BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒随 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统提供，采用基于载体的方法，可高效生成用于在哺乳动物细胞中调节性表达 shRNA 分子的 H1/TO RNAi 盒。要在哺乳动物细胞中对 shRNA 分子进行组成型表达，可使用 BLOCK-iT™ U6 RNAi 入门载体试剂盒或 BLOCK-iT™ 慢病毒 RNAi 表达系统。提供有助于生产和递送合成短干扰 RNA (siRNA)、剪切 siRNA (d-siRNA) 或双链 RNA (dsRNA) 的其他 BLOCK-iT™ RNAi 产品，用于在哺乳动物细胞或无脊椎生物中进行 RNAi 分析（如适用）。有关任何一种 BLOCK-iT™ RNAi 产品和其他 RNAi 资源的更多信息，请访问 RNAi 中心应用门户网站 www.lifetechnologies.com/RNAi

ViraPower™ 慢病毒 T-REx™ 技术

ViraPower™ T-REx™ 慢病毒技术将 Invitrogen 的 ViraPower™ 慢病毒和 T-REx™ 技术结合在一起，有助于使用无复制能力的慢病毒在体外或体内高效地以四环素调节方式将靶基因或 RNA 递送至分裂和非分裂哺乳动物细胞。在 Cell Genesys 开发的 lentikat™ 系统（Dull 等人，1998）的基础上，ViraPower™ T-REx™ 慢病毒技术增强了该系统的生物安全性，同时可在比传统逆转录病毒系统更广泛的细胞类型中进行高水平表达。ViraPower™ T-REx™ 慢病毒技术的主要组分包括：

  • 一种基于 pLenti 的表达载体，感兴趣 DNA 序列将被克隆到其中。该载体包含可将表达构建体包装到病毒体中并可使用抗生素抗性标记物选择稳定转导细胞系的元件。
  • pLenti6/TR 表达载体，用于在 CMV 启动子的控制下实现 Tet 抑制子的高水平、组成型表达。该载体包含可将构建体包装到病毒体中并可使用杀稻瘟菌素抗性标记物选择稳定转导细胞系的元件。
  • ViraPower™ 包装混合物是一种经优化的混合物，包含生成慢病毒所需的三种包装质粒。
  • 优化的 293FT 细胞系，有助于获得极佳的病毒生成结果。


Gateway 技术

Gateway 技术是一种通用的克隆方法，利用噬菌体 λ 的位点特异性重组特性 (Landy, 1989)，可以快速高效地将您的感兴趣 DNA 序列移入多个载体系统中。只需以下操作，即可使用 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统和 Gateway 技术在哺乳动物细胞中表达感兴趣 shRNA：

  1. 将编码感兴趣 shRNA 的双链寡核苷酸克隆到 pENTR™/H1/TO 入门载体中，以创建入门克隆。如需要，可将此入门克隆直接转染到哺乳动物细胞中，以进行初始筛选。

  2. 通过在 pENTR™/H1/TO 入门克隆与 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体之间进行 LR 重组反应，生成表达克隆。

  3. 使用您的表达克隆和试剂盒中提供的试剂生成慢病毒。

  4. 将慢病毒构建体转导至表达 TetR 的哺乳动物细胞中，然后添加四环素以诱导感兴趣 shRNA 的表达。对稳定转导的细胞进行选择（如需要）。

 

材料

试剂盒类型 

产品货号
BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统K4925-00
BLOCK-iT™ 慢病毒 RNAi Zeo Gateway 载体试剂盒V488-20


试剂盒组分
 
BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统和 BLOCK-iT™ 慢病毒 RNAi Zeo Gateway 载体试剂盒包括以下组分。

组分
 
货号
 
V488-20K4925-00
pLenti4/BLOCK-iT™-DEST Gateway 载体试剂盒
XX
Gateway LR Clonase™ II 酶混合物
 X
One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌XX
pLenti6/TR 载体 X
杀稻瘟菌素 X
ViraPower™ Zeo 慢病毒支持试剂盒 X
293FT 细胞系 X
BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒 X


运输/储存

BLOCK-iT™ 慢病毒 RNAi 试剂盒按如下所述运输。接收后，请按如下所述储存每种产品。有关 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒中提供的试剂的更多详细信息，请参阅 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒手册。
 
注：  BLOCK-iT™ 慢病毒 RNAi Zeo Gateway 载体试剂盒仅包括盒 1 和 3。

盒
组分
运输
储存
1
pLenti4/BLOCK-iT™-DEST Gateway 载体试剂盒
室温
 -20°
 
2
Gateway LR Clonase™ II 酶混合物
干冰
-20°C
3
One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌
干冰
-80°C
4pLenti6/TR 载体室温-20°C
5杀稻瘟菌素室温-20°C
6ViraPower™ Zeo 慢病毒支持试剂盒蓝冰ViraPower™ 包装混合物：-20°C
Zeocin™：-20°C，避光储存
Lipofectamine 2000：+4° C（切勿冷冻）
7293FT 细胞系干冰液氮
8-9BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒干冰诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂：-20°C
四环素：-20°C，避光储存
One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌：-80°C


载体

BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统（盒 1 和 4）包括以下载体。将载体储存在 -20°C 下。
 
重要提示：BLOCK-iT™ 慢病毒 RNAi Zeo Gateway 载体试剂盒不包括 pLenti6/TR 载体。

试剂
组成
供应量
以冻干形式溶于 TE 缓冲液（pH 值 8.0）
6 µg
pLenti4-GW/H1/TO-lamin shRNA 对照质粒
以冻干形式溶于 TE 缓冲液（pH 值 8.0）
10 µL
pLenti6/TR
以冻干形式溶于 TE 缓冲液（pH 值 8.0）
20 µg


Gateway LR Clonase™ II 酶混合物

Gateway LR Clonase™ II 酶混合物（盒 2）包括以下试剂。可在 -20°C 下储存长达 6 个月。如需长期储存，则储存在 -80°C 下。

试剂
组成
供应量
Gateway LR Clonase™ II 酶混合物专利配方40 mL
蛋白酶 K 溶液
2 µg/µL，溶于：
10 mM Tris-HCl（pH 值 7.5）
20 mM CaCl2
50% 甘油
 
40 mL
pENTR™-gus 阳性对照
50 ng/µL，溶于 TE 缓冲液（pH 值 8.0）
20 µL


注：LR Clonase™ II 酶混合物中包括的 pENTR™-gus 对照仅可用作 LR 重组反应的阳性对照。请勿使用产生的表达克隆生成慢病毒用于表达，因为 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体不含真核启动子，且 gus 基因将不在哺乳动物细胞中表达。
 
One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌

One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌试剂盒（盒 3）包括以下试剂。转化效率不小于 1 x 108 cfu/µg 质粒 DNA。储存在 -80°C 下。

试剂
组成
供应量
S.O.C.培养基
2% 胰蛋白胨
0.5% 酵母提取物
10 mM NaCl
2.5 mM KCl
10 mM MgCl2
10 mM MgSO4
20 mM 葡萄糖
6 mL
Stbl3™ 细胞
--
21 x 50 µL
pUC19 对照 DNA
10 pg/µL，溶于 5 mM Tris-HCl、0.5 mM EDTA（pH 值 8）
50 µL


ViraPower™ 慢病毒支持试剂盒试剂

下表列出了杀稻瘟菌素（盒 5）和 ViraPower™ Zeo 慢病毒支持试剂盒（盒 6）中包括的试剂。储存条件如下：

  • ViraPower™ 包装混合物和杀稻瘟菌素：-20°C
  • Zeocin™：-20°C，避光储存
  • Lipofectamine 2000 试剂：+4°C。

 
重要提示： 切勿冷冻 Lipofectamine 2000 试剂。

试剂
组成
供应量
ViraPower™ 包装混合物
包含 pLP1、pLP2 和 pLP/VSVG 质粒的混合物，以冻干形式溶于 TE 缓冲液（pH 值 8.0）
195 µg
Lipofectamine 2000 试剂
专利配方
0.75 mL
Zeocin™
100 mg/mL 无菌去离子水溶液
125 mg
杀稻瘟菌素
粉末
50 mg


293FT 细胞系

BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统包括用于生成慢病毒储备液的 293FT 细胞系（盒 7）。293FT 细胞系以小瓶装形式提供，1 小瓶含 3 x 106 个冷冻细胞，置于 1 mL 冻存培养基中。接收后储存于液氮中。

 
BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒

BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统包括 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒，有助于生成包含用于感兴趣短发夹 RNA (shRNA) 的四环素调节表达的 H1/TO RNAi 盒的 Gateway 入门构建体。BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒含有：

  • 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂和四环素（盒 8）
  • One Shot TOP10

系统的生物安全特点

介绍

BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统中提供的慢病毒和包装载体是 Dull 等人 (1998) 开发的基于慢病毒载体的第三代载体。这一基于 HIV-1 的第三代慢病毒系统具有多种安全性特点，旨在提高其生物安全性并尽可能降低其与野生型人 HIV-1 病毒的关系。下文将讨论这些安全性特点。
 
BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统的生物安全性特点

BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统包括以下关键安全性特点：

  • pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 和 pLenti6/TR 载体在 3' LTR (DU3) 处包含一个缺失，该缺失不影响生产细胞系中病毒基因组的生成，但在靶细胞转导后会导致慢病毒的“自失活”（Yee 等人，1987；Yu 等人，1986；Zuferey 等人，1998）。一旦整合到转导的靶细胞中，慢病毒基因组就不能再产生可包装病毒基因组。
  • 系统中使用的来自 HIV-1 的基因数量已减少到三个（即 gag、pol 和 rev）。
  • 来自水泡性口炎病毒的 VSV-G 基因用于替代 HIV-1 包膜（Burns 等人，1993；Emi 等人，1991；Yee 等人，1994）。
  • 将编码病毒基因组包装所需的结构和其他组分的基因分到四种质粒（即三种包装质粒和 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 或 pLenti6/TR）上。所有四种质粒均已经过工程改造而不含任何与彼此同源的区域，以防止出现可能导致有复制能力的病毒产生的非期望重组事件（Dull 等人，1998）。
  • 尽管三种包装质粒能够在 293FT 生产细胞系中反向表达生成子代病毒所需的蛋白（例如 gal、pol、rev、env），但它们均不含 LTR 或 Y 包装序列。这意味着在包装病毒基因组中实际上不存在 HIV-1 结构基因，因此从未在转导的靶细胞中表达。不能产生新的有复制能力的病毒。
  • 该系统产生的慢病毒颗粒无复制能力，并且仅携带感兴趣基因。不会产生其他病毒物种。
  • pLP1 中的 gag 和 pol 基因的表达因 gag/pol mRNA 转录本中的 HIV-1 RRE 而呈现出 Rev 依赖性。添加 RRE 可防止在不存在 Rev 的情况下对 gag 和 pol 表达产生影响（Dull 等人，1998）。
  • 组成型启动子（RSV 启动子）已被置于 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 和 pLenti6/TR 载体中 5' LTR 的上游，不需要 Tat 即可高效生成病毒 RNA（Dull 等人，1998）。 

生物安全等级 2
 
尽管包含上述安全性特点，但使用该系统产生的慢病毒仍会造成一些生物危害性风险，因为它可以转导原代人细胞。因此，我们强烈建议您将使用此系统生成的慢病毒储备液视为生物安全等级 2 (BL-2) 微生物，并严格遵循所有已发表的 BL-2 指南，并进行适当的废弃物净化。此外，在创建表达靶向参与控制细胞分裂的人类基因（例如肿瘤抑制基因）的慢病毒的 shRNA 时，应格外谨慎。

请按照既定的机构指南处理所有慢病毒。由于各机构对慢病毒使用和处理的安全性要求可能有所不同，因此我们建议在使用 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统之前，查阅您所在机构的健康和安全指南和/或咨询相关官员。
 

实验概述

生成入门克隆

 

介绍

要通过 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 表达您的感兴趣 shRNA，您首先需要使用 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒在 pENTR™/H1/TO 载体中生成一个入门克隆。下方提供了一般指南。
 
要以四环素调节方式表达您的感兴趣 shRNA，请注意，您必须使用 pENTR™/H1/TO 入门载体来生成包含 shRNA 序列的入门克隆。尽管有多种 Gateway 入门载体可供选择来帮助生成入门克隆，但只有 pENTR™/H1/TO 入门载体包含有助于在哺乳动物细胞中正确表达调节的 shRNA 分子所需的元件。这些元件包括： 

  • 人 H1/TO 启动子，其是一种 RNA 聚合酶 III 依赖性启动子，有助于在哺乳动物细胞中高水平地以四环素调节方式表达感兴趣 shRNA（Hannon 等人，1991；Myslinksi 等人，2001）。
  • 用于 shRNA 分子的高效转录终止的聚合酶 III (Pol III) 终止子。 

BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒随货号为 K4925-00 的产品提供，但也可从 Invitrogen 单独购买。

使用 pENTR™/H1/TO

要在 pENTR™/H1/TO 中生成入门克隆，您将：

  • 根据指定的指南设计和合成两种可编码 shRNA 目标序列的互补寡核苷酸
  • 对寡核苷酸进行退火处理，以形成双链寡核苷酸
  • 使用优化的 5 分钟连接程序将双链寡核苷酸克隆到 pENTR™/H1/TO 中
  • 转化感受态大肠杆菌并对入门克隆进行选择

有关生成入门克隆的详细说明和指南，请参阅 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒手册。本手册随货号为 K4925-00 的产品一起提供，但也可从我们的网站 ( www.invitrogen.com) 下载，或致电技术服务部获取。
创建表达克隆
 
生成入门克隆后，您即可通过使用 pENTR™/H1/TO 入门构建体和 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体进行 LR 重组反应，以生成表达克隆。为确保获得理想结果，我们建议您在开始前阅读本部分和标题为“进行 LR 重组反应”和“转化 One Shot Stbl3™ 感受态大肠杆菌”的部分。
 
实验概述

要生成表达克隆，您需要：
 
  1. 使用含有 attL 的 pENTR™/H1/TO 入门克隆和含有 attR 的 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体进行 LR 重组反应。注： 入门克隆和目的载体都应进行超螺旋（请参见下文的“重要说明”）。
  2. 将反应混合物转化至合适的大肠杆菌宿主中。
  3. 对表达克隆进行选择。

pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体以超螺旋质粒形式提供。尽管 Gateway 技术手册先前曾建议使用线性化目的载体以进行更高效的 LR 重组，但在 Invitrogen 进行的进一步检测发现，无需对 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 进行线性化，也可获得任何下游应用的优化结果
 
重悬目的载体

pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体以 6 µg 质粒形式提供，以冻干形式溶于 TE 缓冲液（pH 值 8.0）。使用时，仅需将目的质粒重悬于 40 µL 无菌水中，使最终浓度达到 150 ng/µL。
 
增殖目的载体

如果您想增殖和维持 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体，我们建议使用来自 Invitrogen 的 Library Efficiency DB3.1™ 感受态大肠杆菌（货号 11782-018）进行转化。DB3.1™ 大肠杆菌菌株对 CcdB 效应具有抗性，并可支持含 ccdB 基因的质粒的增殖。
 
注：  请勿使用 Stbl3™、TOP10 或 DH5a 等通用大肠杆菌克隆菌株进行增殖和维持，因为这些菌株对 CcdB 效应很敏感。
 
增殖目的载体的指南

使用 DB3.1™ 大肠杆菌来增殖 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 质粒时，请遵循以下指南：

  • 为了维持载体的完整性，在含有 50-100 µg/mL 氨苄青霉素和 15-30 µg/mL 氯霉素的培养基中对转化体进行选择。
  • 由于 5' 与 3' LTR 之间发生的重组（即不需要的重组体）可能会导致慢病毒载体重排，因此我们建议在继续操作前分析转化体以验证目的载体的完整性。
  • 增殖转化体时，在 LB 培养基中培养细菌。请勿使用“更完全”的细菌培养基，因为这些培养基往往会产生更多不需要的重组体。

pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 的重组区域

通过 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST x pENTR™/H1/TO 入门克隆获得的表达克隆的重组区域如下所示。
 
重组区域的特点：

  • 阴影区域对应于通过重组从 pENTR™/H1/TO 入门克隆转移到 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体中的 DNA 序列。非阴影区域为来自 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体的序列。

注： 从 pENTR™/H1/TO 入门克隆转移的 DNA 序列包含一个 H1/TO RNAi 盒，该盒含有人 H1/TO 启动子 + 编码感兴趣 shRNA 的 ds oligo + Pol III 终止子。

  • 会注明转录起始位点。请注意，转录从人 H1/TO 启动子序列结束后的第一个核苷酸处启动。
  • pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 序列的碱基 1868 和 3551：





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进行 LR 重组反应

介绍

按照本部分中的指南和说明，使用 pENTR™/H1/TO 入门克隆和 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体进行 LR 重组反应。我们建议您在实验中加入阴性对照（不含 LR Clonase™ II），以帮助您评估结果。
 
建议的大肠杆菌宿主

为获得较佳结果，我们建议使用 Stbl3™ 大肠杆菌进行转化，因为该菌株特别适用于克隆不稳定 DNA，如含有正向重复序列的慢病毒 DNA。One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌包含在用于转化的试剂盒中。有关说明，请参见“转化 One Shot Stbl3™ 感受态大肠杆菌”。请注意，当使用 Stbl3™ 大肠杆菌进行转化时，获得含有不需要的重组体的转化体的频率较低（参见下方的注释）。

如需要，您可将 LR 重组反应物转化至其他 recA、endA 大肠杆菌菌株中，包括 TOP10 和 DH5a™。然而，请注意，这些菌株不太适合克隆不稳定的 DNA，并且当在仅含氨苄青霉素的平板上选择时，可能产生较低百分比 (<5%) 的含有不需要的重组体的转化体（即在 5' 与 3' LTR 之间发生重组的质粒）。如果您想使用 TOP10 或 DH5a™ 细胞进行转化，请遵循以下指南以降低出现不需要的重组体的频率：

  • 使用含有 100 µg/mL 氨苄青霉素和 50 µg/mL Zeocin™ 的低盐 LB 对转化体进行选择。请注意，转化的大肠杆菌在含氨苄青霉素和 Zeocin™ 的 LB 培养基中生长更慢，且可能需要稍长的孵育时间才能获得可见菌落。有关 Zeocin™ 的更多信息，请参见附录。
  • 选择较小菌落用于分析，因为含有在 5' 与 3' LTR 之间发生重组的质粒的转化体（即不需要的重组体）产生的菌落通常大于含有完整质粒的菌落。

请勿将 LR 重组反应物转化至含有 F' 附加体的大肠杆菌菌株（例如 TOP10F'）中。这些菌株含有 ccdA 基因，无法使用 ccdB 基因进行阴性选择。
 
LR Clonase™ II 酶混合物

LR Clonase™ II 酶混合物随试剂盒（仅限货号 K4925-00）提供，也可从 Invitrogen 单独购买，用于催化 LR 重组反应。LR Clonase™ II 酶混合物将专利酶配方和 5X LR Clonase 反应缓冲液（先前在 LR Clonase™ 酶混合物中作为单独组分提供）结合在一起，配制成优化的单管规格，以便更轻松地配制 LR 重组反应。使用第 24 页提供的方案，使用 LR Clonase™ II 酶混合物进行 LR 重组反应。

注：  如需要，您可以使用 LR Clonase™ 酶混合物进行 LR 重组反应。要使用 LR Clonase™ 酶混合物，请遵循随产品提供的方案进行操作。请勿使用本手册中提供的 LR Clonase™ II 酶混合物的方案。

LR 反应的阳性对照

LR Clonase™ II 酶混合物包括 pENTR™-gus 质粒，可用作 LR 重组反应的阳性对照。您可以在 LR 重组反应中使用这种入门克隆来验证 LR 反应的效率。然而，由于 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体和 pENTR™-gus 都不包括用于控制哺乳动物细胞中 gus 基因表达的真核启动子，因此不能将得到的表达克隆用作表达对照。有关 pENTR™-gus 的图谱，请参见附录，第 90 页。

需要的材料

在开始之前，您应准备好以下材料：

  • 您的 pENTR™/H1/TO 入门克隆的纯化质粒 DNA（50-150 ng/µL，溶于 TE 缓冲液，pH 值 8.0）
  • pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体（150 ng/µL，溶于 TE 缓冲液，pH 值 8.0）
  • pENTR™-gus 对照（如需要，随货号为 K4925-00 的产品提供，盒 2）
  • LR Clonase™ II 酶混合物（随货号为 K4925-00 的产品提供，盒 2；使用前应始终储存于 -20°C 下）
  • 2 µg/µL 蛋白酶 K 溶液（随货号为 K4925-00 的产品提供，盒 2；解冻并在使用前放置在冰上）
  • TE 缓冲液（pH 值 8.0）（10 mM Tris-HCl，pH 值 8.0、1 mM EDTA）
  • 0.5 mL 无菌微量离心管

配制 LR 重组反应

按照此程序进行 pENTR™/H1/TO 入门克隆与 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体之间的 LR 反应。如果您想包括阴性对照，则需配制单独反应，但无需使用 LR Clonase™ II 酶混合物。
 
 1.    在室温下将以下组分添加到 0.5 mL 微量离心管中并混合。

组分
样本
阳性对照
入门克隆（50-150 ng/反应）
1-7 µL
--
pENTR™-gus (50 ng/µL)
--
2 µL
pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体（150 ng/µL）
1 µL
1 µL
TE 缓冲液（pH 值 8.0）
至 8 µL
5 µL

  2.  从 -20°C 条件下取出 LR Clonase™ II 酶混合物，并在冰上解冻（约 2 分钟）。
 
  3.    将 LR Clonase™ II 酶混合物短暂涡旋处理两次（每次 2 秒）。
 
  4.    向上述样本中，添加 2 µL LR Clonase™ II 酶混合物。上下吹吸混匀。
 
提醒：  使用后，立即将 LR Clonase™ II 酶混合物放回 -20°C 条件下。
 
  5.    在 25°C 下孵育反应物 1 小时。
 
注：  将孵育时间延长至 18 小时通常会产生更多集落。
 
 6.    向各反应物中添加 1 µL 蛋白酶 K 溶液。在 37°C 下孵育 10 分钟。
 
 7.    继续进行“转化 One Shot Stbl3™ 感受态大肠杆菌”

注： 如需要，转化前，您可将 LR 反应物储存在 -20°C 下长达 1 周。



转化 One Shot Stbl3™ 感受态大肠杆菌

介绍

按照本部分中的说明，将 LR 重组反应物转化至 One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌（随试剂盒提供，盒 8）。One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌的转化效率为 1 x 10 8 cfu/µg 质粒 DNA。
 
需要的材料

您需要以下材料：

  • LR 重组反应 • One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌（随试剂盒提供，盒 8；每次转化使用 1 小瓶；临使用前在冰上解冻）
  • S.O.C.培养基（随试剂盒提供，盒 8；加热至室温）
  • pUC19 阳性对照（验证转化效率时使用；随试剂盒提供，盒 8）
  • LB 培养基（进行 pUC19 对照转化时使用）
  • 42°C 水浴
  • 含 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板（每次转化使用两个；使用前在 37°C 下预热 30 分钟）
  • 37°C 振摇培养箱和非振摇培养箱 

One Shot Stbl3™ 转化程序

按照此程序，将 LR 重组反应物转化至 One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌。
 
  1. 每次转化时，在冰上解冻一瓶 One Shot Stbl3™ 化学感受态细胞。

  2. 将 2 至 3 µL LR 重组反应物添加到一瓶 One Shot Stbl3™ 细胞中，并轻轻混匀。请勿通过上下吹吸混匀。对于 pUC19 对照，将 10 pg (1 µL) DNA 添加到另一瓶 One Shot 细胞中，并轻轻混匀。

  3. 在冰上孵育小瓶 30 分钟。

  4. 在 42°C 下热激细胞 45 秒，请勿振摇。

  5. 从 42°C 水浴中取出小瓶，将其放置在冰上 2 分钟。

  6. 添加 250 µL 预热的 S.O.C。培养基。

  7. 将瓶盖紧，并在振摇培养箱中于 37°C 下以 225 rpm 水平振摇 1 小时。

  8. 取 25-100 µL 转化混合物涂布于预热的选择性平板上并于 37°C 下孵育过夜。建议使用两种不同的体积进行铺板，确保至少有一个平板产生间隔合适的菌落。对于 pUC19 对照，将转化混合物以 1:10 的比例在 LB 培养基中稀释，并对 25-100 µL 转化混合物进行铺板。

  9. 将剩余转化混合物储存在 +4°C 下。如需要，次日对额外细胞进行铺板。
 

预期结果

使用 One Shot Stbl3™ 化学感受态细胞进行转化时，如果对全部 LR 重组反应物进行转化和铺板，应产生超过 4,000 个菌落。
 
确认表达克隆

ccdB 基因突变频率非常低，所以假阳性数量非常少。真正的表达克隆对氯霉素具有敏感性，对氨苄青霉素和杀稻瘟菌素具有抗性。含有带突变 ccdB 基因的质粒的转化体对氯霉素、氨苄青霉素和杀稻瘟菌素具有抗性。要检查假定表达克隆，应检测含 30 µg/mL 氯霉素的 LB 平板上的生长情况。真正的表达克隆在存在氯霉素的情况下不生长。
 
测序

无需对表达构建体进行测序，因为将 H1/TO RNAi 盒从 pENTR™/H1/TO 转移到 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体的过程中保留了盒的方向。然而，如果您想在 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 中对 H1/TO RNAi 盒进行测序，我们建议使用以下引物。

引物
序列
H1 正向
5'-TGTTCTGGGAAATCACCATA-3'
V5（C 末端）反向
5'-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3'

注： 为方便起见，Invitrogen 还提供定制引物合成服务。有关更多信息，请访问我们的网站 ( www.invitrogen.com)，也可致电技术服务部。
 
维持表达克隆

生成表达克隆后，在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中维持表达克隆并让其增殖。

 

在 293FT 细胞中生产慢病毒

 

介绍

在您创建表达 miRNA 的稳定转导细胞系之前，您首先需要将优化的 ViraPower™ 包装混合物和 pLenti6/V5-GW/miR 表达构建体共转染至 293FT 生产细胞系中，借此生成慢病毒储备液（含有包装的 pLenti6/V5 表达构建体）。以下部分提供了生成慢病毒储备液的方案和说明。
 
实验概述

要在 293FT 细胞中生产慢病毒，您需要：
 
  1. 培养 293FT 细胞，以获得 6 x 106 个 293FT 细胞（就每份样本而言）。

  2. 制备表达克隆的质粒 DNA。

  3. 使用 Lipofectamine 2000 将 ViraPower™ 包装混合物和 pLenti6/V5-GW/miR 表达质粒 DNA 共转染至 293FT 细胞。

  4. 转染后 48-72 小时收获含有病毒的上清液。
 
293FT 细胞系

人 293FT 细胞系随 BLOCK-iT™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 试剂盒一起提供，有助于实现较佳的慢病毒生产（Naldini 等人，1996）。293FT 细胞系是 293F 细胞系的衍生物，能够稳定且组成性地表达 pCMVSPORT6TAg.neo 中的 SV40 大 T 抗原，必须保存在含有 Geneticin 的培养基中。有关 pCMVSPORT6TAg.neo 以及如何培养和保存 293FT 细胞的更多信息，请参阅 293FT 细胞系手册。本手册随 BLOCK-iT™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 试剂盒一起提供，也可从我们的网站 ( www.invitrogen.com) 或致电技术服务部获得  确保细胞存活率大于 90%。
 
注：  293FT 细胞系可从 Invitrogen 单独购买。

在转染时，293FT 细胞的健康状况对慢病毒的成功生产具有关键影响。使用“不健康”细胞会对转染效率产生负面影响，导致产生低滴度慢病毒储备液。为实现较佳的慢病毒生产（即生产具有预期滴度的慢病毒储备液），在用于转染前，按照以下指南培养 293FT 细胞：

  • 按照 293FT 细胞系手册中的建议传代培养和保存细胞。传代前不要让细胞过度生长。每份样本需要 6 x 106 个 293FT 细胞。
  • 使用传代培养次数低于 20 次的细胞。

ViraPower™ 包装混合物


pLP1、pLP2、pLP/VSVG 质粒以优化混合物的形式提供，可在共转染至 293FT 生产细胞后促进 pLenti6/V5-GW/miR 表达载体的病毒包装。
 
BLOCK-iT™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 试剂盒中提供的包装混合物 (195 µg) 和 Lipofectamine 2000 试剂 (0.75 mL) 的量足以按照推荐方案在 10 cm 板中进行 20 次共转染。要使用 ViraPower™ 包装混合物，请将一管 (195 µg) 内容物重悬于 195 µL 无菌水中，以获得 1 µg/µL 储备液。
 
注： ViraPower™ 包装混合物可从 Invitrogen 单独购买，也可作为 ViraPower™ Bsd 慢病毒支持试剂盒的一部分购买。
 
质粒制备

生成表达克隆后，您必须分离质粒 DNA 进行转染。转染至真核细胞中的质粒 DNA 必须非常干净，无苯酚和氯化钠污染。污染物会杀死细胞，盐会干扰脂质络合，降低转染效率。我们建议使用 PureLink™ 质粒纯化试剂盒或 CsCl 梯度离心分离质粒 DNA。
 
将纯化的 pLenti6/V5-GW/miR 表达质粒重悬于无菌水或 TE 缓冲液（pH 值 8.0）中，使最终浓度处于 0.1-3.0 µg/µL 范围内。每次转染需要 3 µg 表达质粒。
 
重要提示：  请勿使用小提质粒 DNA 进行转染。
 
Lipofectamine 2000

随 BLOCK-iT™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 试剂盒提供的 Lipofectamine 2000 试剂是一种具有专利技术的阳离子脂质配方，适用于将核酸转染至真核细胞中（Ciccarone 等人，1999）。使用 Lipofectamine 2000 转染 293FT 细胞具有以下优势：

  • 在 293FT 细胞中能获得较高的转染效率
  • DNA-Lipofectamine 2000 复合物可在存在血清的情况下直接添加到培养基中的细胞中
  • 转染后无需去除复合物或更换培养基或添加培养基，不过，4-6 小时后可以在不影响活性的情况下去除复合物

注：  Lipofectamine 2000 可从 Invitrogen 单独购买，也可作为 ViraPower™ Bsd 慢病毒支持试剂盒的一部分购买。
 
要帮助形成理想的 DNA-Lipofectamine 2000 复合物，我们建议使用 Opti-MEM I

miR 阳性对照

您可以使用试剂盒中包含的试剂生成 miR 阳性对照，如下所示：

  • 使用 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒中随附的 lacZ 双链寡核苷酸和 pcDNA™6.2-GW/+EmGFP-miR 表达载体，按照表达载体手册中所述的方式生成 pcDNA™6.2-GW/+EmGFP-miR-lacZ 表达对照。
  • 按照本手册所述，使用 pcDNA™6.2-GW/+EmGFP-miR-lacZ 表达对照，利用 Rapid BP/LR 重组反应、通过 pLenti6-V5-DEST 载体生成慢病毒构建体。
  • 使用得到的慢病毒表达构建体 pLenti6/V5-GW/+EmGFP-miR-lacZ，生成 miR 对照慢病毒储备液（靶向 lacZ 的 miRNA）。
  • 生成后，可将 miR 对照慢病毒转导至哺乳动物细胞系中，以表达靶向人 lacZ 基因的 miRNA，并可用作这些细胞系中 RNAi 反应的对照。

pLenti6/V5-GW/lacZ 阳性对照


pLenti6/V5-GW/lacZ 阳性对照载体随附于 pLenti6/V5-DEST 载体中，在 ViraPower™ 慢病毒表达系统中用作阳性对照。β-半乳糖苷酶表达为 C 端标签融合蛋白，可通过 Western 印迹或功能检测轻松检出。
 
要增殖和维持对照质粒：
 
  1. 将载体重悬于 10 µL 无菌水中，制备 1 µg/µL 储备液。

  2. 使用储备液转化 recA、endA 大肠杆菌菌株（如 Stbl3™、TOP10、DH5a™-T1R 或同等菌株）。使用 10 ng 质粒进行转化。

  3. 在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素（用于 Stbl3™ 细胞）的 LB 琼脂平板或含有 100 µg/mL 氨苄青霉素和 50 µg/mL 杀稻瘟菌素（用于 TOP10 或 DH5a）的 LB 琼脂平板上选择转化体。

  4. 制备含有质粒的转化体的甘油储备液，用于长期储存。让质粒在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 中增殖 

  5. 使用 pLenti6/V5-GW/lacZ 阳性对照生成对照慢病毒储备液（表达 LacZ 蛋白）。

  6. 在共转导实验中，使用 pLenti6/V5-GW/lacZ 慢病毒对照和 pLenti6/V5-GW/+EmGFP-miR-lacZ 慢病毒对照作为阳性对照，用于在您的系统中进行慢病毒诱导的 RNAi 分析。


需要的材料

在开始之前，您应准备好以下材料：

  • pLenti6/V5-GW/miR 表达构建体（含 0.1-3.0 µg/µL 的无菌水或 TE 缓冲液，pH 值 8.0）
  • 阳性对照（参见上文以生成阳性对照；重悬于无菌水中，浓度为 1 µg/µL）
  • ViraPower™ 包装混合物（随试剂盒提供；重悬于 195 µL 无菌水中，浓度为 1 µg/µL）
  • 在适当的培养基（即含有 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM MEM 非必需氨基酸和 1% 青霉素/链霉素的 D-MEM）中培养的 293FT 细胞。每份样本需要 6 x 106 个 293FT 细胞。
  • Lipofectamine 2000 转染试剂（随试剂盒提供；在 +4°C 下储存并在使用前轻轻混匀）
  • Opti-MEM I 减血清培养基
  • 胎牛血清 (FBS)
  • 含有丙酮酸钠的完全生长培养基（即含有 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM MEM 非必需氨基酸、1% 青霉素/链霉素和 1 mM MEM 丙酮酸钠的 D-MEM）  注： MEM 丙酮酸钠可为细胞提供额外的能量来源，可从 Invitrogen 以 100 mM 储备液（货号 11360-070）形式购买。
  • 10 cm 无菌组织培养板（慢病毒构建体和对照各一个）
  • 无菌组织培养用品
  • 5 和 15 mL 无菌带盖锥形管
  • 冻存管
 
推荐的转染条件

我们使用以下经优化的转染条件在 293FT 细胞中生产慢病毒储备液。使用这些推荐条件以 1 x 10 5 至 1 x 10 7 转导单位 (TU)/mL 的滴度生产的慢病毒的量通常足以在感染复数 (MOI) = 1 下转导 1 x 10 6 至 1 x 10 8 个细胞。


条件
用量
组织培养板规格
10 cm（每种慢病毒构建体一个）
要转染的 293FT 细胞数量
6 x 106 个细胞
ViraPower™ 包装混合物的量
9 µg（9 µL/1 µg/µL 储备液）
pLenti6/V5-GW/miR 表达质粒的量
3 µg
要使用的 Lipofectamine 2000 试剂的量
36 µL


注：  您可使用其他组织培养形式生成慢病毒储备液，但请记住，要获得预期滴度，需要进行优化。

对慢病毒储备液进行滴度测定

介绍

在继续转导感兴趣的哺乳动物细胞系并表达 miRNA 进行 RNAi 分析之前，我们强烈建议测定慢病毒储备液的滴度。虽然某些应用不需要该程序，但在以下情况下仍有必要：

  • 您希望控制慢病毒的整合拷贝数量
  • 您希望生成可重现的基因敲低结果

 
本部分中提供了指南和方案。
 
滴度测定方法

您可以使用以下任一方法测定慢病毒储备液的滴度：

  • 杀稻瘟菌素选择（通常需要 2 周来测定滴度）
  • EmGFP 检测（通常需要在转导后用 4 天时间测定滴度），如果 miRNA 序列克隆至 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 载体中


实验概述

要测定慢病毒储备液的滴度，您需要：
 

  1. 制备慢病毒储备液的 10 倍系列稀释液。

  2. 在存在聚凝胺的情况下，将慢病毒的不同稀释液转导至所选的哺乳动物细胞系。

  3. 根据使用的滴度测定方法：
  • 使用杀稻瘟菌素对稳定转导的细胞进行选择。对各稀释液中的杀稻瘟菌素抗性集落进行染色并计数。
  • 如果使用 EmGFP，则在转导后 4 天通过流式细胞分析测定滴度。


影响病毒滴度的因素

许多因素会影响慢病毒滴度，包括：

  • 用于滴度测定的细胞系的特性。
  • 慢病毒储备液的陈置时间。在 -80°C 下长期储存时，病毒滴度可能降低。如果慢病毒储备液已储存超过 6 个月，我们建议在 RNAi 实验中使用前，对慢病毒储备液进行滴度测定或重新进行滴度测定。
  • 冻融循环次数。经过每次冻融循环，病毒滴度可降低多达 10%。
  • 慢病毒储备液储存不当。应将慢病毒储备液分装并在 -80°C 下储存。


选择细胞系

您可以使用任何所选的哺乳动物细胞系测定慢病毒储备液的滴度。通常，我们建议您使用与表达研究相同的哺乳动物细胞系来测定慢病毒储备液的滴度。然而，在某些情况下，您可能希望使用不同的细胞系测定慢病毒的滴度（例如，当您在非分裂细胞系或原代细胞系中进行 RNAi 研究时）。在这些情况下，我们建议您选择具有以下特性的细胞系来测定慢病毒的滴度：

  • 贴壁生长的细胞系
  • 易于操作处理
  • 倍增时间范围为 18-25 小时
  • 非迁移


我们通常使用 HT1080 人纤维肉瘤细胞系（ATCC，货号 CCL-121）进行滴度测定。

重要提示：  您可以使用其他细胞系（包括 HeLa 和 NIH/3T3）测定慢病毒的滴度。然而，请注意，使用 HeLa 细胞或 NIH/3T3 细胞时获得的滴度约是使用 HT1080 细胞时获得的滴度的十分之一。

  • 慢病毒构建体的滴度可能因选择的细胞系而异。如果您有多个慢病毒构建体，我们建议您使用相同的哺乳动物细胞系测定所有慢病毒构建体的滴度。


杀稻瘟菌素选择

pLenti6/V5-GW/miR 表达构建体包含杀稻瘟菌素抗性基因 (bsd)（Kimura 等人，1994），可用于已稳定转导慢病毒构建体的哺乳动物细胞的杀稻瘟菌素选择（Takeuchi 等人，1958；Yamaguchi 等人，1965）。

如果您使用的是 BLOCK-iT™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 试剂盒，杀稻瘟菌素会随该试剂盒提供。此外，杀稻瘟菌素可从 Invitrogen 单独购买，也可作为 ViraPower™ Bsd 慢病毒支持试剂盒的一部分购买（有关订购信息，请参见第 ix 页）。有关如何制备和处理杀稻瘟菌素以及确定杀稻瘟菌素敏感性的更多信息，请参阅附录。

转导期间使用聚凝胺

如果在存在海美溴铵（聚凝胺）的情况下转导细胞，可能会使慢病毒至哺乳动物细胞的转导增强。为获得较佳结果，我们建议在存在聚凝胺的情况下进行转导。但是，请注意，一些细胞（例如原代神经元）对聚凝胺敏感。在进行任何转导实验之前，您可能需要测试细胞系对聚凝胺的敏感性。如果细胞对聚凝胺敏感（例如，显示毒性或表型变化），请勿在转导期间添加聚凝胺。在这种情况下，仍可以成功转导细胞。

制备和储存聚凝胺

按照以下说明制备聚凝胺（Sigma，货号 H9268）：

  1. 在去离子无菌水中制备 6 mg/mL 储备液。

  2. 过滤除菌，并将 1 mL 等份试液分装至无菌微量离心管中。

  3. 在 -20°C 下储存以便进行长期储存。储备液可在 -20°C 下储存长达 1 年。切勿冻融储备液超过 3 次，因为这可能导致活性损失。 注：工作储备液可在 +4°C 下储存长达 2 周。


需要的材料

您需要以下材料：

  • 您的 Lenti6/V5-DEST 慢病毒储备液（使用前在 -80°C 下储存）
  • 所选的贴壁哺乳动物细胞系
  • 用于细胞系的完全培养基
  • 6 mg/mL 聚凝胺（如需要）
  • 6 孔组织培养板
  • 杀稻瘟菌素（10 mg/mL 储备液）和结晶紫（Sigma，货号 C3886；在 10% 乙醇中制备 1% 结晶紫溶液）（如果使用杀稻瘟菌素选择进行滴度测定）
  • 倒置荧光显微镜和适当的 EmGFP 可视化滤光片（如果使用 EmGFP 滴度测定方法）
  • 磷酸盐缓冲盐水（PBS；Invitrogen，货号 10010-023）


制备哺乳动物细胞

准备将用于滴度测定的所选哺乳动物细胞系。使用适当的培养基培养细胞。对于每种待测定滴度的慢病毒储备液，需要使用至少一个 6 孔板（一个模拟孔加五份稀释液）。细胞活力应 > 95%。

请记住，您需要使用含有感染性病毒的培养基。遵循针对使用 BL-2 微生物的推荐联邦和机构指南。

  • 在经认证的生物安全柜内执行所有操作。
  • 用漂白剂处理含病毒的培养基。
  • 用漂白剂处理用过的移液管、移液器吸头和其他组织培养用品，并作为生物危害性废弃物进行处置。
  • 在处理病毒储备液和含病毒的培养基时，请佩戴手套、穿实验服并佩戴防护眼镜或护目镜。


转导和滴度测定程序

遵循以下程序，用所选的哺乳动物细胞系测定慢病毒储备液的滴度。注： 如果您已经生成了 pLenti6-V5-GW/miR-lacZ 对照构建体的慢病毒储备液（使用或未使用 EmGFP），则使用杀稻瘟菌素或 EmGFP 方法进行滴度测定；如果您生成了 pLenti6-V5-GW/lacZ 对照构建体的慢病毒储备液，则使用杀稻瘟菌素滴度测定方法。

  1. 在转导前一天（第 1 天），对细胞进行胰蛋白酶化处理和计数，将细胞铺到 6 孔板中，使其在转导时达到 30%-50% 汇合度。在 37°C 下孵育细胞过夜。

    2. 示例： 当使用 HT1080 细胞时，我们通常在 6 孔板中以 2 x 10 5 个细胞/孔的密度进行铺板。

  2. 在转导当天（第 2 天），解冻慢病毒储备液并制备 10 倍系列稀释液，范围为 10-2 至 10-6。对于每次稀释，在完全培养基中稀释慢病毒构建体，最终体积为 1 mL。请勿进行涡旋处理。

    注：  如需要，您可以制备更宽范围的系列稀释液（10-2 至 10-8）。

  3. 从细胞中去除培养基。通过翻转轻轻混匀各稀释液，并添加到一孔细胞中（总体积 = 1 mL）。 

  4. 向各孔中添加聚凝胺（如需要），使得最终浓度为 6 µg/mL。轻轻旋转平板以混匀。在 37°C 下孵育过夜。

  5. 次日（第 3 天），去除含有病毒的培养基，并更换为 2 mL 完全培养基。

  6. 次日（第 4 天），继续执行步骤 7-8（EmGFP 滴度测定方法）或继续执行步骤 9-14（杀稻瘟菌素滴度测定方法）。

  7. 在第 4 天通过流式细胞分析进行滴度测定，以测定 EmGFP 滴度。对于 6 孔板的每个病毒稀释孔，对细胞进行胰蛋白酶化处理并在完全培养基中重悬细胞，使浓度达到 10-500 个细胞/mL。

  8. 使用流式细胞分析系统，测定每次稀释的 GFP 阳性细胞的百分比。

  9. 对于杀稻瘟菌素选择，在第 4 天去除培养基，并更换为含有适量杀稻瘟菌素的完全培养基，以便对稳定转导的细胞进行选择。

  10. 每 3-4 天更换含有杀稻瘟菌素的新鲜培养基。

  11. 在选择 10-12 天（第 14-16 天）后，您将不会在模拟孔中观察到活细胞，在一个或多个稀释孔中应观察到分散的杀稻瘟菌素抗性集落。去除培养基并用 PBS 洗涤细胞两次。

  12. 添加结晶紫溶液（6 孔培养皿为 1 mL；10 cm 板为 5 mL），并在室温下孵育 10 分钟。

  13. 去除结晶紫染色剂并用 PBS 洗涤细胞。重复洗涤。

  14. 对蓝色染色集落进行计数，并测定慢病毒储备液滴度。




制备用于流式细胞分析的细胞

如果您使用了 EmGFP 滴度测定方法，根据您在流式细胞分析设施上应用的既定方案，制备用于流式细胞分析的细胞。 以下步骤提供了一般指导原则，其他方法可能适用。

  1. 转导后第 4 天，使用胰蛋白酶或细胞解离缓冲液将细胞从平板上解离。

  2. 以低速离心细胞，从而去除残留培养基组分，并以在您的流式细胞仪上进行分析所需的密度将细胞沉淀重悬在流式细胞分析缓冲液（如含 1% FBS 的无钙/镁的 PBS）中。固定细胞不是分析的必要步骤，但如果需要，可进行固定。注：要在进行流式细胞分析之前固定细胞，请使用含 2% 甲醛或多聚甲醛的无钙/镁 PBS 溶液。然而，这些固定剂可能会提高细胞的自发荧光，因此务必要将固定模拟转导细胞作为流式细胞分析的阴性对照包括在内。

  3. 使用模拟转导细胞和最低稀释度病毒（即 10-2）分别作为阴性和阳性样本，以设置流式细胞仪参数。



计算慢病毒滴度

根据 EmGFP 阳性细胞百分比处于 1-30% 范围内的稀释度计算 EmGFP 慢病毒滴度（Sastry 等人，2002；White 等人，1999）。这是为了避免对含有多种整合慢病毒基因组的稀释样本（可能导致低估病毒滴度）或含有太少转导细胞的稀释样本（将产生不准确的结果）进行分析。滴度以转导单位 (TU)/mL 表示。

使用以下公式计算滴度： 

[F x C/V] x D

F = GFP 阳性细胞频率（获得的百分比除以 100）

C = 转导时孔中的细胞总数

V = 接种物体积 (mL)

D = 慢病毒稀释度

计算慢病毒滴度的示例如下。采用上述方案生成 EmGFP 慢病毒储备液。进行流式细胞分析后，将生成以下数据：

慢病毒稀释% EmGFP 阳性细胞
10-291.5%
10-334.6%
10-44.4%


在上述示例中，使用 10-4 的稀释度计算滴度，因为 EmGFP 阳性细胞的百分比会落入 1-30% 的期望范围内。EmGFP 阳性细胞的频率为 4.4/100 = 0.044，再乘以 2 × 105（孔中的细胞数）除以 1（接种物体积）。因此，计算如下：

[(0.044 x 200,000)/1] x 104

该示例的慢病毒滴度为 8.8 × 107 TU/mL。

预期结果

当使用 HT1080 细胞对 pLenti6/V5 慢病毒储备液进行滴度测定时，我们通常获得的滴度范围为 5 x 105 至 2 x 107 转导单位 (TU)/mL。

有关使用杀稻瘟菌素的典型滴度测定实验所得预期结果示例，请参见下文。

注：如果慢病毒储备液的滴度低于 1 x 105 TU/mL，我们建议生成新的慢病毒储备液。有关优化病毒得率的更多提示和指南，请参见“疑难解答”部分。

使用杀稻瘟菌素滴度测定法的预期结果示例

在本实验中，使用之前的方案生成 pLenti6 慢病毒储备液。按照方案使用 10 倍系列稀释的慢病毒上清液（10-2 至 10-6 稀释）转导 HT1080 细胞或不进行转导（模拟）。转导后 48 小时，对细胞进行杀稻瘟菌素选择 (10 µg/mL)。选择 10 天后，用结晶紫对细胞染色（参见下文板），并对集落进行计数。

因此，此慢病毒储备液的滴度为 4.8 x 106 TU/mL（即平均为 46 x 105 和 5 x 106）。

共转导和四环素调节表达

 

介绍

本部分提供了进行以下操作的相关指南和说明：将 Lenti6/TR 和 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体共转导至所选哺乳动物细胞系中、使用四环素诱导 shRNA 表达以及检测靶基因敲低情况。如果您有单个 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体并且您希望验证感兴趣 shRNA 是否可以在哺乳动物细胞系中进行诱导性表达，我们建议使用此程序。

如果您有多种 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体，我们建议先生成表达 Tet 抑制子的稳定细胞系，并且使用该细胞系作为慢病毒构建体的宿主（请参见“ 生成表达 TetR 的宿主细胞系”）。

注：  如果您希望组成型表达感兴趣基因，只需以合适的 MOI 将 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 构建体单独转导到细胞中即可。
 
在进行共转导程序时，我们强烈建议您使用经滴度测定的 Lenti6/TR 和 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒储备液。当以高于 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 构建体的 MOI（参见“用于转导的 MOI”）将 Lenti6/TR 构建体转导至哺乳动物细胞时，通常可获得较佳表达结果（即低基础和高诱导性靶基因敲低）。根据使用的细胞系和感兴趣靶基因的性质，您可能需要改变转导至宿主细胞中的 Lenti6/TR 慢病毒:Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒的比例，以优化基础和诱导性 shRNA 表达水平。这最好在已经知道每种慢病毒储备液滴度时完成。
 
实验概述

要使用共转导程序表达感兴趣 shRNA，您需要：
 
  1. 以合适的 MOI（如 MOI = 10）将 Lenti6/TR 慢病毒构建体转导至哺乳动物细胞中。

  2. 将细胞孵育 24 小时，然后使用 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体，以略低的 MOI（例如 MOI = 1-5）来转导含 Lenti6/TR 的细胞。

  3. 将细胞孵育 24 小时，然后去除含培养基的病毒。

  4. 将细胞孵育 24 小时，然后添加四环素以诱导感兴趣 shRNA 的表达。或者，使用杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 对稳定转导的细胞进行选择（如需要）。一旦生成稳定细胞系，您就可以添加四环素以诱导感兴趣 shRNA 的表达。
 
在进行共转导程序时，您必须在转导 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 表达构建体之前将 Lenti6/TR 慢病毒构建体转导到哺乳动物细胞中，以实现四环素调节的感兴趣 shRNA 的表达。我们通常在转导 Lenti6/TR 构建体后等待至少 24 小时，然后转导 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 构建体，以便留出时间表达 Tet 抑制子。

用于转导的 MOI

您可以以任何合适的 MOI 将 Lenti6/TR 和 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体转导到哺乳动物细胞系中（参见“确定最佳 MOI”）。但请注意，为了充分抑制感兴趣 shRNA 的基础转录，同时仍然获得较高水平的四环素诱导的表达，我们建议以高于 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 构建体的 MOI 将 Lenti6/TR 构建体转导到细胞中。我们建议以 10 为起点 MOI 将 Lenti6/TR 构建体转导到细胞中，以 1 至 5 为起点 MOI 将 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 构建体转导到细胞中。您可以通过改变转导的 Lenti6/TR 和/或 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒的 MOI 来优化基础和四环素诱导的表达水平。

需要的材料

在开始之前，您应准备好以下材料：

  • 经滴度测定的 Lenti6/TR 慢病毒储备液（使用前在 -80°C 下储存）
  • 经滴度测定的 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒储备液（使用前在 -80°C 下储存）
  • 经滴度测定的 Lenti4-GW/H1/TO-laminshRNA 慢病毒储备液（如需要，使用前在 -80°C 下储存）
  • 所选的哺乳动物细胞系
  • 用于细胞系的完全培养基
  • 6 mg/mL 聚凝胺（如需要）
  • 适合您应用的适当大小的组织培养板
  • 10 µg/mL 四环素（随货号为 K4925-00 的产品提供，盒 8；避光储存）
  • 10 mg/mL 杀稻瘟菌素储备液（如果是对稳定转导的 Lenti6/TR 细胞进行选择）
  • 100 mg/mL Zeocin™ 储备液（如果是对稳定转导的 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 细胞进行选择）

共转导程序

遵循以下程序使用 Lenti6/TR 和 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体来共转导所选哺乳动物细胞系，以检测四环素调节靶基因敲低情况。我们建议加入阴性对照（模拟转导），以帮助您评估结果。如果是对稳定细胞系进行选择，则请包括两份阴性对照样本，一份用于杀稻瘟菌素选择，另一份用于 Zeocin™ 选择。
 
  1. 在适合您应用的完全生长培养基中对细胞进行铺板。

  2. 在转导当天（第 1 天），解冻 Lenti6/TR 慢病毒储备液并在新鲜完全培养基中稀释（如需要）适量病毒（以适当的 MOI；建议 MOI = 10）。将含有病毒的培养基的总体积保持在尽可能低的水平，以尽可能提高转导效率。请勿进行涡旋处理。

  3. 从细胞中去除培养基。通过吹吸轻轻混匀含有病毒的培养基，并添加到细胞中。

  4. 添加聚凝胺（如需要），使得最终浓度为 6 µg/mL。轻轻旋转平板以混匀。在 37°C 下孵育过夜。

  5. 在 Lenti6/TR 病毒转导后 24 小时（第 2 天），解冻 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒储备液并在新鲜完全培养基中稀释（如需要）适量病毒（以适当的 MOI；建议 MOI = 1 至 5）。将含有病毒的培养基的总体积保持在尽可能低的水平，以尽可能提高转导效率。请勿进行涡旋处理。

  6. 从细胞中去除含 Lenti6/TR 病毒的培养基。通过吹吸轻轻混匀含 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 病毒的培养基，并添加到含 Lenti6/TR 病毒的细胞中。

  7. 添加聚凝胺（如需要），使得最终浓度为 6 µg/mL。轻轻旋转平板以混匀。在 37°C 下孵育过夜。

  8. 在 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 病毒转导后 24 小时（第 3 天），请执行以下操作之一：

    • 瞬时敲低实验：去除含有病毒的培养基，并更换为含有 1 µg/mL 四环素的新鲜完全培养基。在 37°C 下孵育细胞 24-48 小时，然后检测靶基因敲低情况。如果您希望稍后再进行细胞检测，请继续培养细胞，或者根据需要将其重新铺到更大尺寸的组织培养容器中含有四环素的培养基中。
    • 稳定细胞系：去除培养基，并更换为含有适量杀稻瘟菌素的新鲜完全培养基。在 37°C 下孵育细胞 24 小时，然后对细胞进行胰蛋白酶化处理，并将细胞重新铺到更大尺寸的组织培养容器中含有杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 的新鲜完全培养基中。然后转到步骤 9。

    示例： 如果在 6 孔板中转导细胞，则对细胞进行胰蛋白酶化处理，并将细胞重新铺到 10 cm 组织培养板中，然后进行杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 选择。仅用于稳定细胞系

  9. 每 2-3 天将培养基更换为含有杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 的新鲜培养基，直至可鉴定杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性集落（通常在选择后 10-14 天）。
     
    注：  以高 MOI 使用 Lenti6/TR 和 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒转导细胞可能导致大多数细胞具有杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性。在这种情况下，您可能无法在进行稳定选择时看到明显的杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性集落。您也可能不会看到许多未转导的细胞（即死细胞）。

  10. 至少挑选 10 个杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性集落（参见下文注释）并扩增每个克隆。或者，您可以合并杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性细胞的异质群体。 

  11. 通过添加四环素，使最终浓度达到 1 µg/mL，从而诱导感兴趣 shRNA 的表达。在检测靶基因敲低情况之前，等待一段适当的时间（例如 24-48 小时）。


    12. 慢病毒整合至基因组的过程是随机的。您可能会看到不同杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性克隆的靶基因敲低水平因整合位点周围基因组序列的影响而异。我们建议至少检测 10 种杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性克隆，并选择可提供较低水平基础和较高水平诱导靶基因敲低的克隆以供进一步研究。
     
    进行 RNAi 分析



    预期结果



    预期结果示例

    检测核纤层蛋白 A/C 表达情况





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生成表达 TetR 的宿主细胞系

介绍

一旦您已进行共转导程序并确定 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 构建体可被诱导性表达，您可能希望建立一个可组成型表达 Tet 抑制子并诱导性表达感兴趣 shRNA 的稳定细胞系。我们建议先创建仅表达 Tet 抑制子的稳定细胞系，然后使用该细胞系作为 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体的宿主。
 
Invitrogen 可提供几种稳定表达 Tet 抑制子的 T-REx™ 细胞系（有关订购信息参见第 x 页）。如果您希望在 293、HeLa、CHO 或 Jurkat 细胞中检测感兴趣基因的四环素调节表达，您可能希望使用其中一种 T-REx™ 细胞系作为 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体的宿主。
 
注： T-REx™ 细胞系可通过 pcDNA™6/TR 表达质粒稳定表达 Tet 抑制子。使用该质粒在 Invitrogen 的 T-REx™ 系统中生成稳定的表达 TetR 的细胞系。pLenti6/TR 和 pcDNA™6/TR 均包含相同的 TetR 基因。有关 T-REx™ 细胞系或 pcDNA™6/TR 的更多信息，请访问我们的网站 (www.invitrogen.com) 或联系技术服务部。
 
注意：  尽管 T-REx™-HeLa 细胞系适用于诱导型基因表达实验，但使用 Lenti4-GW/H1/TO-laminshRNA 慢病毒进行转导后，该细胞系显示出相当显著的核纤层蛋白 A/C 基因基础水平敲低 (~20%)。添加四环素后达到的核纤层蛋白 A/C 基因敲低水平 > 90%。如果您正在对参与细胞生长控制或活力的基因进行 RNAi 分析，您可能需要使用另一种 T-REx™ 细胞系或者生成您自己的表达 TetR 的细胞系。

在生成表达 Tet 抑制子的稳定细胞系时，您需要对可表达较高水平 Tet 抑制子的克隆进行选择，以用作诱导型 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体的宿主。那些表达较高水平 Tet 抑制子的克隆应表现出对感兴趣 shRNA 基础转录的较完全抑制，从而在不存在四环素的情况下实现较低水平的靶基因敲低。
 
需要的材料

在开始之前，您应准备好以下材料：

  • 经滴度测定的 Lenti6/TR 慢病毒储备液（使用前在 -80°C 下储存）
  • 所选的哺乳动物细胞系
  • 用于细胞系的完全培养基
  • 6 mg/mL 聚凝胺（如需要）
  • 适合您应用的适当大小的组织培养板
  • 10 mg/mL 杀稻瘟菌素储备液


Lenti6/TR 转导程序

遵循以下程序用 Lenti6/TR 慢病毒构建体转导所选哺乳动物细胞系并利用杀稻瘟菌素选择生成稳定细胞系。我们建议加入阴性对照（模拟转导），以帮助您评估结果。
 

  1. 在完全生长培养基中对细胞进行铺板（如适用）。

  2. 在转导当天（第 1 天），解冻 Lenti6/TR 慢病毒储备液并在新鲜完全培养基中稀释（如需要）适量病毒（以适当的 MOI；建议 MOI = 10）。将含有病毒的培养基的总体积保持在尽可能低的水平，以尽可能提高转导效率。请勿进行涡旋处理。

  3. 从细胞中去除培养基。通过吹吸轻轻混匀含有病毒的培养基，并添加到细胞中。

  4. 添加聚凝胺（如需要），使得最终浓度为 6 µg/mL。轻轻旋转平板以混匀。在 37°C 下孵育过夜。

  5. 次日（第 2 天），去除含有病毒的培养基，并更换为新鲜的完全培养基。

  6. 次日（第 3 天），去除培养基，并更换为含有适量杀稻瘟菌素的新鲜完全培养基，以便对稳定转导的细胞进行选择。

  7. 每 2-3 天将培养基更换为含有杀稻瘟菌素的新鲜培养基，直至可鉴定杀稻瘟菌素抗性集落（通常在选择后 10-12 天）。
    8.  
    注：  以高 MOI 使用 Lenti6/TR 慢病毒转导细胞可能导致大多数细胞具有杀稻瘟菌素抗性。在这种情况下，您可能无法在进行稳定选择时看到明显的杀稻瘟菌素抗性集落。您也可能不会看到许多未转导的细胞（即死细胞）。

  8. 请至少挑选 10 个杀稻瘟菌素抗性集落并扩增每个克隆以检测 Tet 抑制子表达情况（参见下文）。或者，您可以合并杀稻瘟菌素抗性细胞的异质群体并筛选 Tet 抑制子表达。


 
提醒：慢病毒整合至基因组的过程是随机的。您可能会看到不同杀稻瘟菌素抗性克隆的 Tet 抑制子表达水平因整合位点周围基因组序列的影响而异。我们建议至少检测 10 种杀稻瘟菌素抗性克隆并选择可提供较高水平 Tet 抑制子表达的克隆，以用作 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 构建体的宿主。
 
检测 TetR 表达

要检测 Tet 抑制子表达，我们建议使用抗 Tet 抑制子抗体（MoBiTec，Göttingen，德国，货号 TET01）进行 Western 印迹分析。


维持表达 TetR 的细胞系

在您生成稳定的表达 TetR 的细胞系并确认细胞表达适当水平的 Tet 抑制子后，我们建议进行如下操作：

  • 在含有杀稻瘟菌素的培养基中维持表达 TetR 的细胞系
  • 请记住冷冻并储存早期传代细胞小瓶

 
表达感兴趣 shRNA

要以四环素调节的方式表达感兴趣 shRNA，请使用表达 TetR 的细胞系作为 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体的宿主。转导后，您有两种选项来表达感兴趣 shRNA：

  • 您可以添加四环素并检测瞬时靶基因敲低情况，或者
  • 您可以使用 Zeocin™ 对稳定细胞系进行选择，然后添加四环素以检测靶基因敲低情况


选择最适合您需求的选项。
 
需要的材料

在开始之前，您应准备好以下材料：

  • 经滴度测定的 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒储备液（使用前在 -80°C 下储存）
  • 在含有杀稻瘟菌素的培养基中培养的表达 TetR 的宿主细胞系
  • 含有杀稻瘟菌素的完全培养基
  • 6 mg/mL 聚凝胺（如需要）
  • 10 mg/mL 四环素（随货号为 K4925-00 的产品提供，盒 8；避光储存）
  • 适合您应用的适当大小的组织培养板
  • 100 mg/mL Zeocin™ 储备液（如果是对稳定转导的 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 细胞进行选择）


Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 转导程序

遵循以下程序用 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体转导表达 TetR 的细胞并使用 Zeocin™ 生成稳定细胞系（如需要）。我们建议加入阴性对照（模拟转导），以帮助您评估结果。
 

  1. 在适合您应用的完全生长培养基中对表达 TetR 的细胞进行铺板。如果您计划对稳定转导的细胞进行选择，则在转导当天对细胞进行铺板以使细胞汇合度达到 50-60%。

  2. 在转导当天（第 1 天），解冻 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒储备液，并在含有杀稻瘟菌素的新鲜完全培养基中稀释（如需要）适量病毒（以适当的 MOI；建议 MOI = 1-5）。将含有病毒的培养基的总体积保持在尽可能低的水平，以尽可能提高转导效率。请勿进行涡旋处理。

  3. 从细胞中去除培养基。通过吹吸轻轻混匀含有病毒的培养基，并添加到细胞中。

  4. 添加聚凝胺（如需要），使得最终浓度为 6 µg/mL。轻轻旋转平板以混匀。在 37°C 下孵育过夜。

  5. 次日（第 2 天），去除含有病毒的培养基，并更换为含有杀稻瘟菌素的新鲜完全培养基。在 37°C 下孵育过夜。

  6. 次日（第 3 天），执行以下操作之一：

    • 瞬时敲低实验：去除含有病毒的培养基，并更换为含有 1 µg/mL 四环素的新鲜完全培养基。在 37°C 下孵育细胞 24-48 小时，然后检测靶基因敲低情况。如果您希望稍后再进行检测，请继续培养细胞，或者根据需要将其重新铺到更大尺寸的组织培养容器中含有四环素的培养基中。
    • 稳定细胞系：对细胞进行胰蛋白酶化处理，并将细胞重新铺到更大尺寸的组织培养容器中含有杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 的新鲜完全培养基中。然后转到步骤 7。

    示例： 如果在 6 孔板中转导细胞，则对细胞进行胰蛋白酶化处理，并将细胞重新铺到 10 cm 组织培养板中含有杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 的培养基中。

    仅用于稳定细胞系


  7. 每 2-3 天将培养基更换为含有杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 的新鲜培养基，直至可鉴定杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性集落（通常在选择后 10-14 天）。

  8. 至少挑选 10 个杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性集落并扩增每个克隆。或者，您可以合并杀稻瘟菌素和 Zeocin™ 抗性细胞的异质群体。

  9. 添加四环素，使得最终浓度为 1 µg/mL，从而诱导感兴趣 shRNA 的表达。在检测靶基因敲低情况之前，等待一段适当的时间（例如 24-48 小时）。



预期结果示例

示例 1：T-REx™-HeLa 细胞中
核纤层蛋白 A/C 的四环素调节敲低

在本实验中，生成靶向内源性核纤层蛋白 A/C 基因和 lacZ 报告基因的双链寡核苷酸，并使用 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒将其克隆到 pENTR™/H1/TO 中。使用 LR 重组反应，将 H1/TO-核纤层蛋白和 H1/TO-lacZ RNAi 盒转移至 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体中，以生成 pLenti4-GW/H1/TO-laminshRNA 和 pLenti4-GW/H1/TO-lacZshRNA 表达构建体。按照本手册中的方案，生成慢病毒储备液并使用 HT1080 细胞对其进行滴度测定。

在 MOI 为 3 的条件下，使用每种慢病毒构建体转导铺板于 12 孔板中的 T-REx™-HeLa 细胞。转导后 24 小时，对细胞进行胰蛋白酶化处理，重新铺板，并置于 Zeocin™ (100 µg/mL) 和杀稻瘟菌素 (10 µg/mL) 选择下 3 周。对 Zeocin™ 和杀稻瘟菌素抗性克隆分离株进行铺板，并用 1 µg/mL 四环素处理 6 天。制备细胞裂解物，并使用抗核纤层蛋白 A/C 抗体（BD Biosciences，货号：612162）和抗 b-肌动蛋白抗体（Abcam，货号 ab6276）通过 Western 印迹法分析当量。
 
结果：

  • 核纤层蛋白 A/C 特异性 shRNA 可抑制核纤层蛋白 A/C 基因的四环素调节表达，而使用 lacZ 特异性 shRNA 时未观察到核纤层蛋白 A/C 敲低。添加四环素后，观察到的核纤层蛋白 A/C 敲低程度为 > 90%。注：由于启动子渗漏，在不存在四环素的情况下观察到一些核纤层蛋白 A/C 敲低 (~20%)。
  • 使用核纤层蛋白 shRNA 实现的核纤层蛋白 A/C 基因阻断程度与采用充分表征的化学合成 siRNA（Elbashir 等人，2001 年；Harborth 等人，2001）实现的程度相似。


疑难解答

介绍

查看本部分中的信息，以解决在重组和慢病毒表达实验中遇到的问题。
 
LR 反应和转化

下表列举了进行 LR 重组和转化程序疑难解答时，一些潜在的问题及可能的解决方案。

问题
原因
解决方案
从样本反应和转化对照品中获得的菌落极少或未获得菌落
用于对转化体进行选择的抗生素不正确
在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上对转化体进行选择。
 
LR 重组反应物未经蛋白酶 K 处理
转化前，使用蛋白酶 K 处理反应物。
 
未使用建议量的 LR Clonase™ II 酶混合物或 LR Clonase™ II 酶混合物无活性
  • 请确保将 LR Clonase™ II 酶混合物储存在 -20°C 下。
  • 请勿将 LR Clonase™ II 酶混合物冻融超过 10 次。
  • 使用建议量的 LR Clonase™ II 酶混合物
  • 检测另一份 LR Clonase™ II 酶混合物等份试液。
 转化的 LR 反应物不足将 2-3 µL 的 LR 反应物转化至 One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌中。
 没有足够的转化混合物用于铺板增加用于铺板的大肠杆菌量。
 在对转化混合物进行铺板之前，未经历 1 小时的生长期热激步骤后，添加 S.O.C. 培养基，并在铺板前在 37°C 下孵育并振摇转化混合物 1 小时。
 LR 反应中所用的入门克隆 DNA 过多LR 反应中使用 50-150 ng 的入门克隆。
使用 TOP10 大肠杆菌进行转化时，会出现不同大小的菌落（即大菌落和小菌落）部分转化体含有在 5' 与 3' LTR 之间发生了不需要的重组的质粒
  • 在含有 100 µg/mL 氨苄青霉素和 50 µg/mL Zeocin™ 的 LB 平板上对转化体进行选择。
  • 使用随试剂盒提供的 One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌进行转化。Stbl3™ 大肠杆菌建议用于克隆不稳定 DNA（包括含有正向重复的慢病毒 DNA），通常不会产生不需要的重组体。
从转化对照品中获得的菌落极少或未获得菌落感受态细胞储存不正确
  • 将 One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌储存在 -80°C 下。
  • 临使用前，在冰上解冻一瓶 One Shot 细胞。
 添加 DNA 后，通过上下吹吸将感受态细胞混匀添加 DNA 后，轻轻混匀感受态细胞。请勿通过上下吹吸混匀。




生成慢病毒储备液

下表列举了进行共转染和滴度测定实验疑难解答时，一些潜在的问题及可能的解决方案。

 

问题
原因
解决方案
低病毒滴度
转染效率低：
  • 使用质量不佳的表达构建体质粒 DNA（即来自小提的 DNA）
  • 不健康的 293FT 细胞；细胞显示活力较低
  • 在含有抗生素的培养基（即 Geneticin）中转染细胞
  • 质粒 DNA:转染试剂比错误
  • 293FT 细胞铺板过于稀疏
  • 请勿使用来自小提的质粒 DNA 进行转染。使用 S.N.A.P.™ 中提试剂盒或 CsCl 梯度离心，以制备 DNA。
  • 使用传代次数低于 20 次的健康 293FT 细胞；请勿使其过度生长。
  • 请勿在转染期间向培养基中添加抗生素，因为这会降低转染效率并导致细胞死亡。
  • 使用 1:2 至 1:3 范围内的 DNA（单位：µg）:Lipofectamine 2000（单位：µL）比。
  • 对细胞进行铺板，使其在转染时汇合度达到 90-95%，或使用推荐的转染方案（即将细胞添加到含有 DNA:脂质复合物的培养基中）
 
未在含有丙酮酸钠的培养基中培养转染细胞
转染后一天，去除含有 DNA:脂质复合物的培养基，并更换为含有丙酮酸钠的完全培养基。丙酮酸钠可为细胞提供额外能量来源。
 
Lipofectamine 2000 试剂处理错误
  • 储存在 +4°C 下。请勿冷冻。
  • 使用前轻轻翻转混匀。请勿进行涡旋处理
病毒滴度低（续）
病毒上清液收获时间过早
     
通常可在转染后 48-72 小时收集病毒上清液。如果此时许多细胞仍附于平板上，并且看起来处于健康状态，则再等待 24 小时，然后收获病毒上清液。

 

病毒上清液稀释过度

可使用任何一种所选方法病毒 (Yee, 1999)。
 

多次冷冻和解冻病毒上清液		病毒上清液冻融次数请勿超过 3 次。
 
细胞系滴度测定时选择不当
使用 HT1080 细胞或其他贴壁细胞系
 
进行滴度测定程序期间未包括聚凝胺
在存在聚凝胺的情况下，将慢病毒构建体转导至细胞中。
进行滴度测定时未获得集落用于选择的抗生素过多通过执行杀灭曲线实验来确定细胞系的抗生素敏感性。使用杀灭未转导细胞系所需的最少量抗生素。
 病毒储备液储存不正确将储备液等分并储存在 -80°C 下。冻融次数请勿超过 3 次。
 转导过程中未包括聚凝胺在存在聚凝胺的情况下，将慢病毒构建体转导至细胞中。
滴度不确定；细胞汇合用于选择的抗生素过少增加用于选择的抗生素量。
 病毒上清液未充分稀释使用更宽范围的 10 倍系列稀释液（例如 10-2 至 10-8）对慢病毒进行滴度测定。


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转导和调节 shRNA 表达

下表列举了进行转导和四环素调节敲低实验疑难解答时，一些潜在的问题及可能的解决方案。请注意，本部分中提供的疑难解答提示基于以下假设确定：您未组成型表达感兴趣 shRNA。

 

问题
原因
解决方案
四环素诱导后观察到基因敲低水平较低
转导效率较低
                                    
  • 转导过程中未包括聚凝胺
  • 使用非分裂细胞类型
  • 在存在聚凝胺的情况下，将慢病毒构建体转导至细胞中。
  • 使用更高的 MOI 将您的慢病毒构建体转导至细胞中。
四环素诱导后观察到基因敲低水平较低（续）MOI 过低
使用更高的 MOI 将您的慢病毒构建体转导至细胞中。
 
添加四环素 ™ 后过早收获和检测细胞
  • 在四环素添加后至少 48-72 小时后，方可检测靶基因敲低情况，以便留出时间表达和处理 shRNA。
  • 在添加四环素前，将细胞置于 Zeocin™ 选择下并生成稳定细胞系。注：将细胞置于 Zeocin™ 选择下可通过杀灭未转导细胞改善基因敲低结果。
 
靶基因对于细胞活力至关重要
在添加四环素前，将细胞置于 Zeocin™ 选择下并生成稳定细胞系。
 
病毒储备液未进行滴度测定

使用前对慢病毒储备液进行滴度测定。
 

病毒储备液储存不正确
  • 将储备液等分并储存在 -80°C 下。
  • 冻融次数请勿超过 3 次
  • 如果储存时间超过 6 个月，请在使用前重新对储备液进行滴度测定。
 
所选 shRNA 活性较弱选择另一靶标区域。如果可能，首先通过 pENTR™/H1/TO 构建体瞬时转染筛选 shRNA，以验证其活性，然后与 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体进行 LR 重组，并生成慢病毒。
注：通常，瞬时转染会显著过表达 shRNA，因此当从慢病毒构建体表达时，中等活性的 pENTR™/H1/TO 入门克隆的活性可能较低。
未观察到四环素调节基因敲低
未将 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒构建体转导至 Tet 抑制子表达细胞系
 
未观察到四环素调节基因敲低（续）
所选 shRNA 无活性
选择另一靶标区域。如果可能，首先通过 pENTR™/H1/TO 构建体瞬时转染筛选 shRNA，以验证其活性，然后与 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体进行 LR 重组，并生成慢病毒。
     
 
忘记添加四环素
在转导 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒后，添加四环素，使得最终浓度为 1 µg/mL，从而诱导感兴趣 shRNA 的表达。在检测靶基因敲低情况之前至少等待 24 小时。
转导后观察到细胞毒性效应靶基因是保证细胞活力的基本条件在转导 Lenti4/BLOCK-iT™-DEST 慢病毒后，添加 Zeocin™ 





瞬时转染和 RNAi 分析

下表列举了进行瞬时转染和敲低实验疑难解答时，一些潜在的问题及可能的解决方案。

问题
原因
解决方案
观察到低水平
四环素调节
基因敲低
转染效率低（如果使用 Lipofectamine 2000 试剂）
  • 转染过程中在培养基中加入了抗生素
  • 转染时细胞太稀疏
  • 未转染足够的质粒 DNA
  • Lipofectamine 2000 不足

请勿在转染过程中在培养基中加入抗生素。

  • 对细胞进行铺板，使得转染时的汇合度达到 90-95%。
  • 增加转染的质粒 DNA 量。
  • 通过改变 Lipofectamine 2000 用量优化适合所选细胞系的转染条件。
  • 对稳定细胞系进行选择。
 
进行基因敲低检测时间距诱导完成时间太短
  • 重复转染并在诱导过后更久一些再进行基因敲低检测。
  • 进行表达时程分析，确定达到最高基因敲低程度时的时间。
 
pENTR™/H1/TO 构建体中的 ds oligo 插入片段包含突变
在分析卡那霉素抗性转化体时，对 ds oligo 插入片段进行测序以验证其序列。选择包含正确 ds oligo 插入片段的构建体，用于 RNAi 分析。
 
由于以下原因，shRNA 序列并非最佳序列
：
  • 选定的靶标区域
  • shRNA 序列长度（即茎部长度）
  • 环序列
  • shRNA 序列方向
  • 验证 shRNA 序列不包含可导致转录过早终止的 > 3 个串联 T。
  • 选择另一靶标区域。
  • 改变 shRNA 序列长度（例如，如果靶序列为 19 bp，则尝试将茎部长度增加 3 个核苷酸）
  • 选择另一种环序列。
  • 改变环的长度。
  • 将 shRNA 发夹序列方向反转（例如，将寡核苷酸序列从正义-环-反义更改为反义-环-正义方向）。
 
未添加足够的四环素
增加用于诱导的四环素的量
 
靶向一个必需基因
生成稳定细胞系，然后添加四环素以诱导 shRNA 表达。
观察到基因敲低，但不受四环素调节
未将 pENTR™/H1/TO 入门构建体转染至表达 Tet 抑制子的细胞系中
将入门构建体转染至表达 Tet 抑制子的细胞系中：
  • 使用 Invitrogen 的一种 T-REx™ 细胞系
或
  • 根据需要，使用 pcDNA™6/TR 或 pLenti6/TR 生成您自己的表达 TetR 的稳定细胞系。
在非诱导细胞中观察到明显的靶基因敲低
表达的 Tet 抑制子量不足（转染稳定的表达 TetR 的细胞系时）
筛选其他表达 TetR 的克隆。选择表现出较高水平 TetR 表达的克隆，作为 pENTR™/H1/TO 构建体的宿主。
 
共转染 TetR 表达质粒和 pENTR™/H1/TO 构建体
  • 在共转染中使用的 TetR 表达质粒
  • DNA 是 pENTR™/H1/TO 质粒 DNA 的 6 倍。
  • 将 pENTR™/H1/TO 构建体转染至稳定表达 TetR 的细胞系中。
 
当生成表达 TetR 的细胞系时，将 pcDNA™6/TR 或 pLenti6/TR 构建体引入 CMV 启动子下调的哺乳动物细胞系
使用 CMV 启动子未下调的哺乳动物细胞系作为 pcDNA™6/TR 或 pLenti6/TR 构建体的宿主。
即使在四环素诱导后，也未观察到基因敲低
所选 shRNA 无活性
  • 验证 shRNA 序列不包含可导致转录过早终止的 > 3 个串联 T。
  • 选择另一靶标区域。
 
发夹设计不正确
选择靶序列并设计单链寡核苷酸。

 

载体图谱 1 - pLP1 的图谱和特点

pLP1 图谱

请注意，gag 和 pol 基因最初表达为 gag/pol 融合蛋白，然后该蛋白被病毒蛋白酶自切割为单独的 Gag 和 Pol 多聚蛋白。
pLP1 的完整序列可从我们的网站下载，或联系技术服务部获取。
 
pLP1 的特点

pLP1 (8889 bp) 包含以下元素。所有特点均已经过功能检测。
 

特点
优点
人巨细胞病毒 (CMV) 启动子
可实现哺乳动物细胞中 HIV-1 gag 和 pol 基因的高水平表达（Andersson 等人，1989；Boshart 等人，1985；Nelson 等人，1987）。
人 ß-球蛋白内含子
可增强哺乳动物细胞中 gag 和 pol 基因的表达。
HIV-1 gag 编码序列
可编码形成慢病毒结构所需的病毒核心蛋白 (Luciw, 1996)。
HIV-1 pol 编码序列
可编码慢病毒复制和整合所需的病毒复制酶 (Luciw, 1996)。
HIV-1 Rev 应答元件 (RRE)
可实现 gag 和 pol 基因的 Rev 依赖性表达
人 b-球蛋白聚腺苷酸化信号
可实现 mRNA 的高效转录终止和聚腺苷酸化。
pUC 复制起始点 (ori)
可在大肠杆菌中实现高拷贝复制和维持。
氨苄青霉素 (bla) 抗性基因
可在大肠杆菌中进行质粒选择。

载体图谱 2 - pLP2 的图谱和特点

pLP2 的特点

pLP2 (4180 bp) 包含以下元素。所有特点均已经过功能检测。


特点
优点
RSV 增强子/启动子
可实现 rev 基因的高水平表达（Gorman 等人，1982）。
HIV-1 Rev ORF
可编码 Rev 蛋白，该蛋白可与 pLP1 上的 RRE 相互作用，以诱导 Gag 和 Pol 表达，并可与 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 表达载体上的 RRE 相互作用，以促进未剪接病毒 RNA 的核输出，从而包装成病毒颗粒。
HIV-1 LTR 聚腺苷酸化信号
可实现 mRNA 的高效转录终止和聚腺苷酸化。
氨苄青霉素 (bla) 抗性基因
可在大肠杆菌中进行质粒选择。
pUC 复制起始点 (ori)
可在大肠杆菌中实现高拷贝复制和维持。


载体图谱 3 - pENTR™-gus 的图谱

描述

pENTR™-gus 是一种包含拟南芥 b-葡糖苷酸酶 (gus) 基因的 3841 bp 入门克隆（Kertbundit 等人，1991）。使用含有 attB 重组位点的 PCR 引物扩增 gus 基因。然后使用扩增 PCR 产物与 pDONR201™ 进行 BP 重组反应，以生成入门克隆。有关 BP 重组反应的更多信息，请参阅 Clonase™ II Gateway 技术手册，该手册可从我们的网站下载或联系技术服务部获取。

载体图谱 4 - pLenti4-GW/H1/TO-核纤层蛋白 shRNA 的图谱

描述

pLenti4-GW/H1/TO-laminshRNA 是一种表达靶向核纤层蛋白 A/C 基因的 shRNA 的 6656 bp 对照载体。使用 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 RNAi 入门载体试剂盒中提供的试剂，将编码核纤层蛋白 shRNA 的双链寡核苷酸克隆至 pENTR™/H1/TO 载体中，以生成包含 H1/TO-laminshRNA RNAi 盒的入门构建体。使用 Gateway LR 重组反应，将 H1/TO-laminshRNA RNAi 盒转移至 pLenti4/BLOCK-iT™-DEST 载体中，以生成 pLenti4-GW/H1/TO-laminshRNA 载体。该载体已被完全测序。
 
pLenti4-GW/H1/TO-laminshRNA 的图谱
 
pLenti4-GW/H1/TO-laminshRNA 载体的完整序列可从我们的网站 ( www.invitrogen.com) 下载，或联系技术服务部获取。

配方

LB (Luria-Bertani) 培养基
1.0% 胰蛋白胨
0.5% 酵母提取物
1.0% NaCl
pH 值 7.0
 
 1.  为获得 1 升溶液，将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g NaCl 溶于 950 mL 去离子水中。
 
 2.    使用 NaOH 将溶液的 pH 值调整至 7.0，并使体积达到 1 升。
 
 3.   在液体循环时进行 20 分钟高压灭菌。可将溶液冷却至约 55°C 并添加抗生素（如需要）。
 
 4.    储存在 +4°C 下。
 
含有氨苄青霉素和杀稻瘟菌素的 LB 平板

按照以下说明制备含有氨苄青霉素和杀稻瘟菌素的 LB 琼脂平板。
 
重要的注意事项：  杀稻瘟菌素的稳定性可能受到高温的影响，因此，我们不建议在温热 LB 琼脂中添加杀稻瘟菌素。添加杀稻瘟菌素前，将 LB 琼脂冷却至室温。
 
 1.   如上所述，制备 LB 培养基，但在高压灭菌前要加入 15 g/L 琼脂。
 
 2.   在液体循环时进行 20 分钟高压灭菌。
 
 3.   在高压灭菌后，冷却至约 55°C，添加氨苄青霉素，使得最终浓度为 100 µg/mL，并倒入 10 cm 平板中。
 
  4.  使其硬化，然后将 50 µg/mL 杀稻瘟菌素涂抹在各平板上。
 
  5.   倒置并在 +4°C 下于暗处储存。含有杀稻瘟菌素的平板可在 +4°C 下储存长达 2 周。
 
含有 Zeocin™ 的低盐 LB 培养基
10 g 胰蛋白胨
5 g 酵母提取物
5 g NaCl
 
  1.   将胰蛋白胨、酵母提取物和 NaCl 溶于 950 mL 去离子水中。
 
  2.   使用 5 M NaOH 将溶液的 pH 值调整至 7.5，并使体积达到 1 升。对于平板，在高压灭菌前要加入 15 g/L 琼脂。
 
  3.   在液体循环时进行 20 分钟高压灭菌。可将溶液冷却至约 55°C，并添加 Zeocin™，使得最终浓度为 50 µg/mL。
 
  4.   在 +4°C 下于暗处储存。含有 Zeocin™ 的平板可稳定储存 1-2 周。

四环素
 
使用该程序，利用可从 Invitrogen 单独购买的四环素盐（货号 Q100-19）制备 10 mg/mL 储备液。请注意，随 BLOCK-iT™ 诱导型 H1 慢病毒 RNAi 系统提供的四环素为即用型 10 mg/mL 溶液。
 
重要提示：  如果您使用的是另一形式的四环素（即游离碱形式），请用 100% 乙醇而非水制备储备液。
 
  1.   称取 10 mg 四环素并转移至无菌微量离心管中。
 
  2.   将四环素重悬于 1 mL 无菌水中，制备 10 mg/mL 黄色储备液。
 
  3.   用箔包裹试管，并在 -20°C 下避光储存储备液。
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附录 - Zeocin™

Zeocin™ 属于从链霉菌属中分离的结构相关博来霉素/腐草霉素类抗生素家族。该家族中的抗生素是可作为强抗菌药物和抗肿瘤药物的广谱抗生素。它们对细菌、真菌（包括酵母菌）、植物和哺乳动物细胞具有强效毒性（Baron 等人，1992；Drocourt 等人，1990；Mulsant 等人，1988；Perez 等人，1989）。

已分离并表征 Zeocin™ 抗性蛋白（Calmels 等人，1991；Drocourt 等人，1990）。此蛋白是 Sh ble 基因（印度斯坦链异壁菌博来霉素基因）的产物，是一种可结合 Zeocin™ 并抑制其 DNA 链切割活性的 13.7 kDa 蛋白。真核和原核宿主中表达该蛋白使得其对 Zeocin™ 产生抗性。
 
分子量、分子式和结构

Zeocin™ 的分子式为 C60H89N21O21S3，分子量为 1,535。下图显示了 Zeocin™ 的结构。




Zeocin™ 的应用

Zeocin™ 用于在哺乳动物细胞（Mulsant 等人，1988）；植物（Perez 等人，1989）；酵母菌（Baron 等人，1992）；和原核生物（Drocus 等人，1990）中进行选择。用于在哺乳动物细胞系和大肠杆菌中进行选择的 Zeocin™ 的建议浓度如下：

生物体
Zeocin™ 浓度和选择性培养基
大肠杆菌
25-50 µg/mL，溶于低盐 LB 培养基*
哺乳动物细胞
50-1000 µg/mL（因细胞系而异）


*高效选择要求 NaCl 浓度不超过 5 g/L (< 90 mM)。

处理 Zeocin™

  • 高盐和酸度或碱度可使 Zeocin™ 失活。因此，我们建议您减少细菌培养基中的盐，并将 pH 值调整至 7.5，以保持药物活性。请注意，制备含有 Zeocin™ 的组织培养基时，无需调整 pH 值和盐浓度。
  • 在 -20°C 下储存 Zeocin™，并在使用前在冰上解冻。
  • Zeocin™ 对光敏感。在 +4°C 下于暗处储存药物、平板或含有药物的培养基。含有 Zeocin™ 的培养基可在 +4°C 下避光储存长达 1 个月。
  • 在处理含有 Zeocin™ 的溶液时，请佩戴手套、穿实验服并佩戴防护眼镜或护目镜。
  • Zeocin™ 具有毒性。请勿摄入或吸入含有药物的溶液。


制备和存储 Zeocin™
Zeocin™ 以 1.25 mL 等份试液的高压灭菌去离子水溶液形式提供，浓度为 100 mg/mL。如果在 -20°C 下避光储存，可保证 Zeocin™ 稳定储存 6 个月。

附录 - 杀稻瘟菌素

杀稻瘟菌素 S HCl 是一种从灰色链霉菌中分离出的核苷类抗生素，可抑制原核细胞和真核细胞中的蛋白合成（Takeuchi 等人，1958；Yamaguchi 等人，1965）。抗性取决于两种杀稻瘟菌素 S 脱氨酶基因的表达：来自土曲霉的 bsd（Kimura 等人，1994）或来自蜡样芽孢杆菌的 bsr（Izumi 等人，1991）。这些脱氨酶可将杀稻瘟菌素 S 转化为无毒脱氨基羟基衍生物（Izumi 等人，1991）。
 
分子量、分子式和结构

杀稻瘟菌素 S 的分子式为 C17H26N8O5-HCl，分子量为 458.9。下图显示了杀稻瘟菌素的结构。




处理杀稻瘟菌素

处理杀稻瘟菌素时，请始终佩戴手套、面罩、护目镜并穿防护服（例如实验服）。在通风柜中称取杀稻瘟菌素并制备溶液。
 
制备和储存储备液

可从 Invitrogen 单独获取 50 mg 等份试液的杀稻瘟菌素（货号 R210-01）。杀稻瘟菌素可溶于水。通常使用无菌水制备 5 至 10 mg/mL 储备液。

  • 将杀稻瘟菌素溶于无菌水中，并对溶液进行过滤除菌。
  • 可以适用于一次使用的小体积进行等分（参见下文最后一点相邻内容），可在 -20°C 下长期冷冻储存，或可在 +4°C 下进行短期储存。
  • 储备水溶液可在 +4°C 下稳定储存 1-2 周，可在 -20°C 下稳定储存 6-8 周。
  • 水溶液的 pH 值应为 7.0，以防止杀稻瘟菌素失活。
  • 请勿对储备液进行冻融循环（请勿储存在无霜冷冻冰箱中）。
  • 解冻后，根据需要使用，解冻的储备液可在 +4°C 下储存长达 2 周。


含有杀稻瘟菌素的培养基可在 +4°C 下储存长达 2 周。

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