用于高效 RNAi 敲低的剪切 siRNA 库

BLOCK-iT™ Dicer RNAi 转染试剂盒和 BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi 试剂盒可帮助生成纯化的剪切 siRNA 双链体 (d-siRNA)，这些 d-siRNA 适用于对哺乳动物细胞内的靶基因进行 RNAi 分析。试剂盒包含用于剪切 dsRNA 的 BLOCK-iT™ Dicer 酶、纯化 d-siRNA 的试剂，以及可将 d-siRNA 高效递送至哺乳动物细胞的优化转染试剂。
 
注：BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi 试剂盒还包括 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒，可帮助高效生成纯化的 dsRNA。有关更多信息，请参阅 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒手册。该手册随 BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi 试剂盒提供，但也可从 www.invitrogen.com 下载或联系技术支持服务部获取（第 30 页）。
 
BLOCK-iT™ Dicer RNAi 转染试剂盒的优势

使用 BLOCK-iT™ Dicer RNAi 转染试剂盒和 BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi 试剂盒生成用于哺乳动物 RNAi 分析的 d-siRNA，具有如下优势：

• 提供了一种酶促生成一组覆盖靶基因大部分序列（例如 500 bp 至 1 kb）的 d-siRNA 的高性价比的方法，无需进行昂贵的 siRNA 化学合成。
• 提供 BLOCK-iT™ Dicer 酶和一个优化的方案，可帮助从 dsRNA 底物获得较高得率的 d-siRNA。
• 包括用于高效纯化 d-siRNA 的 BLOCK-iT™ RNAi 纯化试剂。纯化的 d-siRNA 可以进行定量，从而实现具有高度可重现性的 RNAi 分析。
• 包括 Lipofectamine 2000 试剂，可以对多种哺乳动物细胞系进行高效转染。

本方案的目的

• 描述 BLOCK-iT™ Dicer RNAi 转染试剂盒内的组分，并概述 d-siRNA 在哺乳动物细胞内促进基因敲低的通路。
• 提供生成针对靶基因的 dsRNA 的指南。有关生成 dsRNA 的详细说明，请参阅 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒手册。
• 使用 BLOCK-iT™ Dicer 酶切割 dsRNA 以生成复杂 d-siRNA 库的指南和说明。
• d-siRNA 纯化说明
• 使用 Lipofectamine 2000 试剂将纯化的 d-siRNA 转染至哺乳动物细胞以进行 RNAi 研究的指南和说明。

RNAi 通路以及 Dicer 工作原理
 
RNAi 通路
RNAi 描述了 dsRNA 通过降解互补信使 RNA (mRNA) 介导强效的特异性真核基因表达抑制的现象，该现象在功能上类似于植物体内的转录后基因沉默 (PTGS) 或共抑制（Cogoni 等人，1994；Napoli 等人，1990；Smith 等人，1990；van der Krol 等人，1990）和真菌中的压制现象（Cogoni 和 Macino，1999；Cogoni 和 Macino，1997；Romano 和 Macino，1992）。在植物中，PTGS 反应被认为是一种自然发生的抗病毒感染或转座子插入的防御现象（Anandalakshmi 等人，1998；Jones 等人，1998；Li 和 Ding，2001；Voinnet 等人，1999）。
 
在真核生物中，体内产生或由病原体导入的 dsRNA 被一种名为 Dicer（双链 RNA 特异性核酸内切酶 RNase III 家族的一员）的酶处理成含 21-23 个核苷酸的双链短干扰 RNA 双链体 (siRNA)（Bernstein 等人，2001；Ketting 等人，2001）。然后每个 siRNA 被整合进一个 RNA 诱导沉默复合物 (RISC)，该酶复合物用于靶向细胞内与 siRNA 互补的转录本，进行特异性切割和降解（Hammond 等人，2000；Nykanen 等人，2001）。
 
有关 RNAi 通路和基因沉默机制的更多信息，请参阅最近的评论（Bosher 和 Labouesse，2000；Hannon，2002；Plasterk 和 Ketting，2000；Zamore，2001）。
 
在哺乳动物细胞内进行 RNAi 分析

现在有很多试剂盒，包括 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒，可帮助在体外生成靶向特定感兴趣基因的 dsRNA。dsRNA 可被直接导入一些无脊椎动物或细胞系内并触发内源 RNAi 通路，导致靶基因抑制。长 dsRNA 双链体在大多数哺乳动物体细胞系内不能直接用于 RNAi 分析，因为长 dsRNA 被导入这些细胞系中会诱导一种非特异性的、干扰素介导的反应，导致翻译停止并引发细胞凋亡 (Kaufman, 1999)。为避免触发干扰素介导的宿主细胞反应，必须向细胞内导入含少于 30 个核苷酸的 dsRNA 双链体（Stark 等人，1998）。要获得最佳的基因敲低研究结果，进一步将导入哺乳动物细胞的 dsRNA 双链体（即，siRNA）的大小限制为 21-23 个核苷酸。

使用该试剂盒进行 RNAi 分析

BLOCK-iT™ Dicer RNAi 转染试剂盒和 BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi 试剂盒可帮助在体外生成靶向特定感兴趣基因的含 21-23 个核苷酸的复杂 siRNA 双链体库。该试剂盒使用一种重组人 Dicer 酶（更多信息见下文）以将长 dsRNA 底物（使用 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒产生）切割为含 21-23 个核苷酸的 d-siRNA 库以便转染至哺乳动物细胞。将 d-siRNA 导入细胞会触发内源 RNAi 通路，导致靶基因的抑制。整个过程的示意图请参见下图。

BLOCK-iT™ Dicer 酶

BLOCK-iT™ Dicer 是一种人源重组酶（Myers 等人，2003；Provost 等人，2002），可持续性地将长 dsRNA 切割为带 2 核苷酸 3' 突出端的含 21-23 个核苷酸的 d-siRNA 双链体。Dicer 是双链 RNA 特异性核酸内切酶 RNase III 家族的一员，含有一个 ATP 依赖性 RNA 螺旋结构域、一个 Piwi/Argonaute/Zwille (PAZ) 结构域、两个 RNase III 结构域以及一个 dsRNA 结合结构域（Bernstein 等人，2001；Zamore，2001）。除了在生成 siRNA 中发挥作用之外，Dicer 还参与从稳定发夹结构或茎环结构前体中加工生成短瞬时 RNA (stRNA)（Hutvagner 等人，2001；Ketting 等人，2001）和 microRNA (miRNA)（Carrington 和 Ambros，2003）。

运输/储存

BLOCK-iT™ Dicer RNAi 试剂盒的运输方式如下所述。接收后，请按如下所述储存每种产品。有关更多随 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒提供的试剂的详细信息，请参阅 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒手册。

BLOCK-iT™ Dicer 酶试剂盒

BLOCK-iT™ Dicer 酶试剂盒包括下列试剂（盒 1）。将试剂储存在 -20°C 下。

单位定义

一单位的 BLOCK-iT™ Dicer 酶在 37°C 下切割 1 µg 双链 RNA (dsRNA) 需要 16 小时。
 
BLOCK-iT™ RNAi 纯化试剂盒

BLOCK-iT™ RNAi 纯化试剂盒（盒 2）包括以下试剂。将试剂储存在室温下。处理 RNA 结合缓冲液时需要小心。（请参见下一页以获取更多信息） 
注：货号 K3650-01 包括两盒 BLOCK-iT™ RNAi 纯化试剂。其中一盒随 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒提供，用于纯化正义和反义单链 RNA (ssRNA)。另一盒用于纯化剪切 siRNA (d-siRNA)。

*siRNA 收集管仅用于 dsiRNA 纯化，ssRNA 纯化时不需要使用此收集管。
 
随 BLOCK-iT™ RNAi 纯化试剂盒提供的 RNA 结合缓冲液包含异硫氰酸胍。该化合物如果接触皮肤或吸入或吞入会导致损伤。处理含有该化合物的溶液时请始终穿戴实验服、一次性手套和护目镜。
 
不要向含有异硫氰酸胍的溶液或样本制备废弃物中直接加入漂白剂或酸性溶液。异硫氰酸胍和漂白剂或酸混合后会产生反应性化合物和有毒气体。
 
Lipofectamine 2000 试剂

每个 BLOCK-iT™ Dicer RNAi 试剂盒都包括用于将 d-siRNA 高效转染至哺乳动物细胞的 Lipofectamine 2000 试剂（盒 3）。Lipofectamine 2000 试剂按如下所述提供：
 
规格：0.75 mL
浓度：1 mg/ml
储存：+ 4°C；切勿冷冻
 
BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒

BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi 试剂盒（货号 K3650-01）包括 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒，可帮助从感兴趣基因生成双链 RNA (dsRNA)。请参阅 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒手册，获取关于该试剂盒内试剂的详细描述和生成 dsRNA 的说明。辅助产品

介绍

本部分所列的产品可与 BLOCK-iT™ Dicer RNAi 试剂盒配合使用。有关更多信息，请参阅我们的网站 (www.invitrogen.com) 或致电技术服务部。

辅助产品
BLOCK-iT™ Dicer RNAi 试剂盒内提供的一些试剂和其他适合与试剂盒配合使用的产品可从 Invitrogen 单独购买。订购信息如下。 

• 选择一段覆盖合理部分的感兴趣基因但不含与其他基因具有高度同源性的区域的序列。
• 限制靶序列大小。尽管可以使用更小或更大的靶序列，但由于以下原因，我们建议将初始靶序列大小限制在 500 bp 至 1 kb 的范围内。

a. 这一长度平衡了包括靶基因与其他基因具有高度同源性的区域而导致 RNAi 分析期间非特异性脱靶效应的风险与获得更复杂 siRNA 库的获益。

b. 生成目标模板的正义和反义转录本时，大小在 500 bp 至 1 kb 范围内的转录本的转录效率最高。在这一大小范围之外的目标模板的转录效率较低，从而导致 dsRNA 的得率也较低。
 
c. 小于 1 kb 的双链 RNA 可被有效剪切。更大的 dsRNA 底物可以使用，但得率可能随大小增加而下降。

• 剪切所需的 dsRNA 量：纯化后，我们在典型的 300 µL 剪切反应中使用 60 µg dsRNA 可回收 12-18 µg d-siRNA。这些 d-siRNA 通常足够用于对铺在 24 孔板内的约 150 孔细胞进行转染。您应该对自己的 RNAi 实验规模和范围有大致认知以确定需要剪切多少 dsRNA。
• 注： 如果要剪切的 dsRNA 少于 60 µg，请按比例缩小剪切反应的规模。
• dsRNA 浓度：剪切反应中的 dsRNA 不应超过反应体积的一半；因此，如果要剪切 60 µg dsRNA，则 dsRNA 的浓度不能小于  400 ng/µL。
• dsRNA 缓冲：我们建议将 dsRNA 样本储存于含有 1 mM EDTA、盐浓度不超过 100 mM 的缓冲溶液中（如 pH 值 7-8 的 TE 缓冲液或 1X RNA 退火缓冲液）。该缓冲条件有助于稳定 dsRNA 并为使用 Dicer 酶进行高效切割提供理想环境。
• 注：如果使用 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒生成 dsRNA，则您的 dsRNA 样本将溶于 1X RNA 退火缓冲液中（10 mM Tris-HCl、20 mM NaCl、1 mM EDTA，pH 值 8.0）。
• dsRNA 质量：要获得较高得率的 d-siRNA，我们建议在剪切反应中使用纯化的 dsRNA。

介绍

一旦生成目标 dsRNA，您便可使用 BLOCK-iT™ Dicer 酶试剂盒（盒 1）中提供的试剂进行体外剪切反应，以生成含 21-23 个核苷酸的 d-siRNA 双链体。
 
BLOCK-iT™ Dicer 酶活性

一单位的 BLOCK-iT™ Dicer 酶在 37°C 下切割 1 µg dsRNA 需要 16 小时。需注意的是，Dicer 酶不会 100% 将 dsRNA 切割为 d-siRNA，即剪切 1 µg dsRNA 不会生成 1 µg d-siRNA。在这些最佳反应条件下，Dicer 酶将 dsRNA 切割为 d-siRNA 的效率约为 25-35%。例如，纯化后，在 300 µL 剪切反应中剪切 60 µg dsRNA 通常可得到 12-18 µg d-siRNA。
 
请注意下列事项：

• 在 300 µL 剪切反应中可以使用超过 60 µg 的 dsRNA，但在这些条件下 BLOCK-iT™ Dicer 酶的效率会下降。尽管您可能得到更高质量的 d-siRNA，但 d-siRNA 的得率将下降。
• 请勿增加剪切反应中的 BLOCK-iT™ Dicer 酶用量（300 µL 反应中不要超过 60 单位）或增加剪切反应的时长（不要超过 18 小时）。如果增加酶用量或时长，BLOCK-iT™ Dicer 酶会与 d-siRNA 结合并将 21-23 nt 的双链体切割为更小产物，从而使 d-siRNA 得率下降。

dsRNA 用量

对于典型的 300 µL 剪切反应，您将需要 60 µg 目标 dsRNA。如果要剪切的 dsRNA 少于 60 µg，请按比例缩小整个反应的规模。
 
加入的 dsRNA 的总体积不应超过反应体积的一半。因此，为获得理想结果，请确保 dsRNA 的起始浓度不小于 400 ng/µL 。

阳性对照

如果您使用的是 BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi 试剂盒，并且使用该试剂盒的 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录部分提供的对照试剂进行了推荐的所有对照反应，则您应该得到代表 lacZ 基因的 1 kb 部分的纯化 dsRNA。我们建议使用对照 lacZ dsRNA 配制单独的剪切和纯化反应物。然后您可以将纯化的 lacZ d-siRNA 和随试剂盒提供的 pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 对照质粒共转染至哺乳动物细胞系作为该细胞系中 RNAi 反应的阳性对照。此外，您可以使用 lacZ d-siRNA 作为细胞系中非特异性脱靶效应的阴性对照。

避免 RNase 污染的步骤

• 所有操作均使用不含 RNase 的无菌移液器吸头和耗材。
• 必要时使用经 DEPC 处理的溶液。
• 处理试剂和溶液以及进行反应时请佩戴手套。

需要的材料

开始前请准备好以下试剂：

• 纯化的 dsRNA（> 400 ng/µL，溶于 pH 值 7-8 的 1X RNA 退火缓冲液或 TE 缓冲液；更多信息请参见第 8 页）
• BLOCK-iT™ Dicer 酶（1 U/µL；随试剂盒提供，盒 1；使用前应始终保存于 -20°C 下）
• 10X Dicer 缓冲液（随试剂盒提供，盒 1）
• 不含 RNase 的水（随试剂盒提供，盒 1）
• 50X Dicer 终止缓冲液（随试剂盒提供，盒 1）

剪切程序

根据以下程序进行剪切反应。确保加入的 dsRNA 体积不超过反应体积的一半（即不超过  150 µL）。
 

1. 在冰上按所示顺序加入下列试剂配制 300 µL 剪切反应物。
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试剂	样本
10X Dicer 缓冲液	30 µL
不含 RNase 的水	最多 210 µL
纯化的 dsRNA (60 µg)	1-150 µL
BLOCK-iT ™ Dicer 酶 (1 U/µL)	60 µL
总体积	300 µL


 

2. 轻轻混匀反应物并在 37°C 下孵育 14-18 小时。
   
   注：反应物的孵育时间不得超过 18 小时，因为这将导致 Dicer 酶切割 d-siRNA，从而降低 d-siRNA 得率。


3. 向反应物中加入 6 µL 50X Dicer 终止液。


4. 如需要，检查 d-siRNA 的完整性。


5. 继续进行 d-siRNA 纯化（参见纯化剪切 siRNA (d-siRNA)）或将剪切反应物在 -20°C 下储存过夜。

检查 d-siRNA 的完整性

如需要，您可以使用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳验证 d-siRNA 的完整性。我们建议在合适的凝胶上运行一份剪切反应物等份试液（300 µL 反应物中取 0.5-1 µL；相当于 100-200 ng dsRNA），并将其与一份起始 dsRNA 等份试液进行比较。确保包括合适的分子量标准品。我们通常使用如下凝胶和分子量标准品：

• 琼脂糖凝胶：4% E-Gel（Invitrogen，货号 G5000-04）
• 聚丙烯酰胺凝胶：20% Novex TBE 凝胶（Invitrogen，货号 EC63152BOX）
• 分子量标准品：10 bp DNA 分子量标准品（Invitrogen，货号 10821-015）

预期结果

通过凝胶电泳分析剪切反应物等份试液时，我们通常看到如下现象：

• 大约 21-23 nt 的代表 d-siRNA 的主条带
• 4% E-Gel：代表未切割 dsRNA 和部分切割产物的高分子量拖尾条带。该条带在琼脂糖凝胶上通常不好分辨并位于胶孔附近。
• Novex 20% TBE 凝胶：代表未切割 dsRNA 和部分切割产物的高分子量条带和拖尾条带。该 dsRNA 条带在聚丙烯酰胺凝胶上通常较好分辨。
• 从琼脂糖凝胶电泳获得的预期结果示例请见下页。如果代表 d-siRNA 的条带较弱或不可见，请参见“疑难解答”部分。

预期结果示例

在该实验中，使用随 BLOCK-iT™ RNAi TOPO 转录试剂盒提供的试剂根据推荐方案生成了代表 lacZ 基因 1 kb 区域的纯化 dsRNA。使用第 10 页的程序对 lacZ dsRNA 进行了剪切。使用 4% E-Gel 分析了剪切反应物（相当于 200 ng dsRNA）和起始 dsRNA 底物等份试液
。 

结果：  在剪切反应物样本（泳道 3）中清晰可见预期大小的代表 d-siRNA 的主要条带。该条带在起始 dsRNA 底物样本（泳道 2）中不可见。

介绍

本部分提供对剪切反应中生成的 d-siRNA 进行纯化的指南和说明。使用随试剂盒提供的 BLOCK-iT™ RNAi 纯化试剂（盒 2）。
 
在进行转染前，需要注意的是您必须对剪切反应中生成的 d-siRNA 进行纯化以去除污染的长 dsRNA 双链体。转染未纯化的 d-siRNA 会触发干扰素介导的反应并导致宿主细胞停止和细胞凋亡。纯化 d-siRNA 时，请严格按照第 16 页所列的纯化程序进行。该程序经优化，可以有效去除污染的长 dsRNA，并且可以高得率回收 d-siRNA。
 
实验概述

要纯化 d-siRNA，您将：
 

1. 向剪切反应物中加入 RNA 结合缓冲液和异丙醇以使蛋白变性并使污染的 dsRNA 与离心柱结合。


2. 将一半体积的样本加入 RNA 离心柱内。dsRNA 将与离心柱内的硅胶膜结合，而 d-siRNA 和变性蛋白将流过离心柱。保留流过物。


3. 将 RNA 离心柱转移至一个 siRNA 收集管并将剩下的样本加入 RNA 离心柱内。重复步骤 2。保留流过物。


4. 将来自步骤 2 和步骤 3 的流过物在 siRNA 收集管中混合并向样本中加入异丙醇以使 d-siRNA 与离心柱结合。


5. 将样本加入另一个 RNA 离心柱。d-siRNA 与离心柱内的滤膜结合。


6. 洗涤与滤膜结合的 d-siRNA，去除残留的 RNA 结合缓冲液、异丙醇以及任何剩余杂质。


7. 用水从 RNA 离心柱上洗脱 d-siRNA。


8. 向洗脱的 d-siRNA 加入 50X RNA 退火缓冲液以稳定 d-siRNA，以便储存。

 

下图显示了 d-siRNA 的纯化过程。

提前准备

在第一次使用 BLOCK-iT™ RNA 纯化试剂前，请向 5X RNA 洗涤缓冲液中加入 10 mL 100% 乙醇以获得 1X RNA 洗涤缓冲液（总体积 = 12.5 mL）。在 5X RNA 洗涤缓冲液的盒标签上打勾以注明乙醇已经添加。将 1X RNA 洗涤缓冲液储存于室温下。
 
RNA 结合缓冲液含有异硫氰酸胍。该化合物如果接触皮肤或吸入或吞入会导致损伤。处理含有该化合物的溶液时请始终穿戴实验服、一次性手套和护目镜。
 
不要向含有异硫氰酸胍的溶液或样本制备废弃物中直接加入漂白剂或酸性溶液。异硫氰酸胍和漂白剂或酸混合后会产生反应性化合物和有毒气体。
 
需要的材料

开始前请准备好以下材料：

• 剪切反应物（来自步骤 5）
• RNA 结合缓冲液（随试剂盒提供，盒 2）
• 2-巯基乙醇
• 异丙醇
• RNA 离心柱（随试剂盒提供，盒 2；每份样本需要 2 个）
• siRNA 收集管（随试剂盒提供，盒 2）
• 1X RNA 洗涤缓冲液（参见上文“提前准备”部分）
• 不含 RNase 的水（随试剂盒提供，盒 2）
• RNA 回收管（随试剂盒提供，盒 2）
• 50X RNA 退火缓冲液（随试剂盒提供，盒 2）
• 不含 RNase 的耗材

d-siRNA 纯化程序返回顶部

使用该程序纯化在 300 µL 反应体积中剪切 60 µg dsRNA 获得的 d-siRNA（参见步骤 5，“进行剪切反应”）。如果您对 < 60 µg dsRNA 进行酶切并且缩小了剪切反应体积，那么请按比例缩小纯化试剂的体积。例如，如果您在 150 µL 剪切反应体积中对 30 µg dsRNA 进行酶切，那么请将所用纯化试剂的体积减半。

重要提示：  开始前，取所需体积的 RNA 结合缓冲液并加入 2-巯基乙醇，使得最终浓度为 1% (v/v)。使用新鲜溶液并丢弃所有未使用的溶液。
 

1. 对每一个剪切反应（约 300 µL 体积），加入含有 1% (v/v) 2-巯基乙醇的 300 µL RNA 结合缓冲液，然后加入 300 µL 异丙醇，得到最终体积 900 µL。上下吹吸 5 次混匀。


2. 向 RNA 离心柱加入一半体积的样本（约 450 µL）。室温下以 14,000 x g 离心 15 秒。


3. 将 RNA 离心柱转移至一个 siRNA 收集管中。保留来自步骤 2 的含 d-siRNA 的流过物。


4. 向 RNA 离心柱加入剩余一半体积的样本（约 450 µL）。室温下以 14,000 x g 离心 2 分钟。


5. 从 siRNA 收集管中移除 RNA 离心柱并丢弃。保留包含 d-siRNA 的流过物。


6. 将来自步骤 2 的流过物（约 450 µL）转移到包含来自步骤 4 的流过物（约 450 µL）的 siRNA 收集管中，得到最终体积约 900 µL。向样本中加入 600 µL 异丙醇，得到最终体积 1.5 mL。上下吹吸混匀。


7.  将三分之一样本（约 500 µL）加入一个新的 RNA 离心柱中。室温下以 14,000 x g 离心 15 秒。弃去流过物。


8. 重复步骤 7 两次，每次向 RNA 离心柱加入剩余样本的三分之一（约 500 µL）。


9. 向含结合的 d-siRNA 的 RNA 离心柱加入 500 µL 的 1X RNA 洗涤缓冲液。室温下以 14,000 x g 离心 15 秒。弃去流过物。


10. 重复洗涤步骤（步骤 9）。


11. 室温下以 14,000 x g 离心 RNA 离心柱 1 分钟以去除离心柱中残留的 1X RNA 洗涤缓冲液并干燥滤膜。


12. 从洗涤管中移除 RNA 离心柱，将其放入一个 RNA 回收管内。


13. 向 RNA 离心柱内加入 30 µL 的不含 RNase 的水。室温下静置 1 分钟，然后室温下以 14,000 x g 离心 RNA 离心柱 2 分钟以洗脱 d-siRNA。继续进行步骤 14。


14. 重复上一页的步骤 13，洗脱 d-siRNA 至同一 RNA 回收管中。洗脱的 d-siRNA 的总体积为 60 µL。


15. 向洗脱的 d-siRNA 中加入 1.2 µL 50X RNA 退火缓冲液，得到最终浓度 1X 的 RNA 退火缓冲液。向样本加入 RNA 退火缓冲液可以增加 d-siRNA 的稳定性。


16. 进一步定量纯化的 d-siRNA（参见下文确定 d-siRNA 纯度和浓度部分）。


17. 将纯化的 d-siRNA 储存于 -80°C 下。根据 d-siRNA 的产量和下游应用，您可能需要先将其分装，再将其储存于 -80°C 下。

 
重要提示：  使用 d-siRNA 时，请避免反复冻融以免 d-siRNA 随每个冻融循环而降解。
 
确定 d-siRNA 的纯度和浓度 

进行下列程序以确定纯化的 d-siRNA 的纯度和浓度。

1. 在 1X RNA 退火缓冲液中将一份纯化的 d-siRNA 等份试液稀释 20 倍，得到适合石英比色皿和分光光度计的总体积。


2. 使用分光光度计测定 A₂₆₀ 和 A₂₈₀ 处的 OD。用 1X RNA 退火缓冲液作为样本的空白对照。


3. 使用下列公式计算 d-siRNA 的浓度： d-siRNA 浓度 (µg/mL) = A₂₆₀ x 稀释系数 (20) x 40 µg/mL


4. 使用下列公式计算 d-siRNA 的得率： d-siRNA 得率 (µg) = d-siRNA 浓度 (µg/mL) x d-siRNA 体积 (mL)


5. 通过测定 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值评估纯化的 d-siRNA 的纯度。最佳纯度 d-siRNA 的 A₂₆₀/A₂₈₀ 比值应该在 1.9-2.2 之间。

 
验证 d-siRNA 质量

如需要，您可以使用聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳验证纯化的 d-siRNA 的质量。我们建议在合适的凝胶上运行一份纯化的 d-siRNA 等份试液 (0.5-1 µL)，并将其与一份剪切反应物等份试液（相当于 100-200 ng dsRNA）进行比较。确保包括合适的分子量标准品。就推荐的凝胶和分子量标准品而言，我们通常使用分析剪切反应物质量时使用的相同凝胶和分子量标准品。 

如果代表纯化 d-siRNA 的条带较弱或不可见，请参见“疑难解答”部分的 d-siRNA 纯化要点。


预期结果示例

在本实验中，使用上述程序对上文所述示例中剪切反应生成的 lacZ d-siRNA 进行了纯化。  使用 4% E-Gel 分析了纯化的 lacZ d-siRNA (80 ng) 和 lacZ 剪切反应等份试液（相当于 200 ng dsRNA）。 

结果：在泳道 3 明显可见预期大小的代表纯化 d-siRNA 的主要条带。纯化的 d-siRNA 样本中没有污染的 dsRNA 或其他高分子量产物。




预期获得多少 d-siRNA

通常在一个 300 µL 剪切反应中剪切 60 µg dsRNA（长度 500 bp 至 1 kb）可获得 12-18 µg d-siRNA，浓度为 200-300 ng/µL。需注意的是得率可能因 dsRNA 长度和质量而异。

介绍

一旦获得纯化的 d-siRNA，您就可以将 d-siRNA 转染至感兴趣哺乳动物细胞系进行 RNAi 分析并检测对于靶基因表达的抑制作用。本部分提供使用随试剂盒提供的 Lipofectamine 2000 试剂（盒 3）将纯化的 d-siRNA 转染至哺乳动物细胞的通用指南和方案。我们提供了建议的转染条件作为初始实验条件。您将需要针对自己的靶基因和哺乳动物细胞系优化转染条件以获得最佳结果。
 
提醒：  必须使用纯化的 d-siRNA 转染哺乳动物细胞。需注意的是使用未纯化的含有污染的长 dsRNA 的 d-siRNA（即直接使用来自剪切反应的材料）转染细胞可能会触发干扰素介导的细胞反应，导致宿主细胞停止和细胞凋亡
。
 
影响基因敲低水平的因素

在 RNAi 实验中，很多因素都会对感兴趣基因表达的下调（即基因敲低）程度产生影响，包括：

• 转染效率
• 感兴趣基因转录速率
• 靶蛋白稳定性
• 哺乳动物细胞系生长特性

设计转染和 RNAi 实验时请考虑这些因素。
 
Lipofectamine 2000 试剂

随试剂盒提供的 Lipofectamine 2000 试剂是一种基于阳离子脂质体的专利配方，适用于将包括 d-siRNA 和 siRNA 的核酸转染至真核细胞（Ciccarone 等人，1999；Gitlin 等人，2002；Yu 等人，2002）。使用 Lipofectamine 2000 将 d-siRNA 转染至真核细胞中具有以下优势：

• 在很多细胞类型中都能获得较高的转染效率
• 它是广泛使用的将 d-siRNA 或 siRNA 递送至真核细胞的转染试剂（Gitlin 等人，2002；Yu 等人，2002）
• d-siRNA-Lipofectamine 2000 复合物可在存在血清的情况下直接加入到培养基中的细胞中。
• 转染后无需去除复合物、更换培养基或添加培养基，不过，4-6 小时后可以在不影响活性的情况下去除复合物。

Lipofectamine 2000 也可从 Invitrogen 单独购买

重要指南

请根据以下指南使用 Lipofectamine 2000 将 siRNA 转染至哺乳动物细胞：
 

1. 细胞密度：要获得最佳结果，我们建议对细胞进行铺板，使得转染时细胞的汇合度达到 30-50%。通常在转染后 24-72 小时检测基因敲低水平。在更低密度时进行转染可以让转染和检测之间的时间间隔更长，并且使细胞过量生长造成的细胞活力损失最小。根据靶基因性质，可能需要更高或更低的细胞密度以优化转染条件。


2. 要获得最佳结果，在复合物形成前请使用 Opti-MEM I 减血清培养基（Invitrogen，货号 31985-062）稀释 Lipofectamine 2000 和 d-siRNA。


3. 请勿在转染期间使用的培养基中包括抗生素，因为这将降低转染效率并引起细胞死亡。

 
需要提前准备好的材料

开始前请准备好以下材料：

• 感兴趣哺乳动物细胞系（确保转染前细胞生长健康并且活细胞比例超过 90%）
• 纯化的感兴趣 d-siRNA (40 ng/µL)
• 注：  如果您剪切了 60 µg dsRNA，那么通常纯化后可得到 12-18 µg d-siRNA，浓度为 200-300 ng/µL
• 阳性对照，如需要（参见下文）
• Lipofectamine 2000 试剂（随试剂盒提供；使用前储存在 +4°C 下）
• Opti-MEM I 减血清培养基（Invitrogen，货号 31985-062；预热）
• 无菌组织培养板和其他组织培养耗材

阳性对照

如果您使用的是 BLOCK-iT™ Complete Dicer RNAi 试剂盒并且剪切了对照 lacZ dsRNA，那么有两种使用得到的纯化 lacZ d-siRNA 进行 RNAi 分析的选择：
 

1. 使用 lacZ d-siRNA 作为非特异性脱靶效应的阴性对照。


2. 用 Lipofectamine 2000 将 lacZ d-siRNA 和随试剂盒提供的 pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 报告基因质粒共转染至哺乳动物细胞，使用 lacZ d-siRNA 作为评估细胞系中 RNAi 反应的阳性对照。转染后 24 小时使用 Western 印迹分析或活性检测方法确定 β-半乳糖苷酶表达的敲低效果。

重要提示：当 d-siRNA 和质粒 DNA 共转染至哺乳动物细胞时，转染条件（即细胞密度和试剂用量）会有轻微的变化。
 
转染程序

根据此程序使用 Lipofectamine 2000 对哺乳动物细胞进行转染。根据下文推荐试剂用量和体积中的表格确定加入不同尺寸的组织培养容器的合适试剂用量和体积。使用推荐的 Lipofectamine 2000 用量作为实验的起始用量，并针对所用的细胞系和 d-siRNA 对转染条件进行优化。
 

1. 转染前一天，在不含抗生素的生长培养基中对适量细胞进行铺板，使得转染时的汇合度达到 30-50%。


2. 对每份转染样本，按下列步骤准备 d-siRNA:Lipofectamine 2000 复合物：



• 使用适量不含血清的 Opti-MEM I 减血清培养基稀释 d-siRNA。轻轻混匀。
• 使用前轻轻混匀 Lipofectamine 2000，然后取适量在 Opti-MEM I 减血清培养基中稀释。轻轻混匀，并在室温下孵育 5 分钟。

 
注：在 30 分钟内混合稀释的 Lipofectamine 2000 和稀释的 d-siRNA。更长的孵育时间会降低转染活性。
 


• 孵育 5 分钟后，混合稀释的 d-siRNA 和稀释的 Lipofectamine 2000。轻轻混匀并在室温下孵育 20 分钟以形成 d-siRNA:Lipofectamine 2000 复合物（溶液可能变得浑浊）。

 

3. 将 d-siRNA:Lipofectamine 2000 复合物加入到含有细胞和培养基的各孔内。通过来回摇动平板轻轻混匀。


4. 将细胞在 37°C 的 CO₂ 培养箱内孵育 24-96 小时直至检测基因敲低效果。无需去除转染复合物或更换培养基；然而，4-6 小时后可以在不影响转染活性的情况下更换生长培养基。

推荐试剂用量和体积

下表列出了用于在不同组织培养形式中转染细胞的推荐试剂用量和体积。使用推荐用量的 d-siRNA（参见第 4 列）和 Lipofectamine 2000（参见第 6 列）作为实验的起始用量，并针对所用细胞系和靶基因对转染条件进行优化。
 

注：对于自动化、高通量系统，建议在 96 孔板中转染更大的复合体积。

优化转染

要获得高转染效率和低非特异性效应，应当通过改变细胞密度（从 30-50% 汇合度开始）和 d-siRNA 用量（参见第 5 列）以及 Lipofectamine 2000 用量（参见第 7 列）对转染条件进行优化。对于那些对转染介导的细胞毒性非常敏感的细胞系（例如 HeLa、HT1080），使用低于表中所列 Lipofectamine 2000 推荐用量（参见第 7 列）的试剂用量。

预期结果

使用 d-siRNA 进行 RNAi 实验时，我们通常在转染后 24 至 96 小时观察到对感兴趣基因的抑制作用。基因敲低的程度取决于检测时间、感兴趣蛋白稳定性以及第 19 页所列的其他因素。需注意的是通常不能观察到 100% 基因敲低，但是在优化的条件下达到 >95% 是可能的。

使用 d-siRNA 进行 RNAi 实验获得的结果示例请见下文。
 
共转染 d-siRNA 和质粒 DNA

如果您使用 lacZ d-siRNA 作为阳性对照以评估细胞系中的 RNAi 反应，您可以将 lacZ d-siRNA 和 pcDNA™ 1.2/V5-GW/lacZ 报告基因质粒共转染至哺乳动物细胞系并在 24 小时后检测对 β-半乳糖苷酶表达的抑制作用。共转染 d-siRNA 和质粒 DNA 时，请按照前一页的程序进行，以下情况例外：

• 对细胞进行铺板，使得转染时的汇合度达到 90%。
• 根据下表确定特定组织培养形式对应的推荐 d-siRNA（参见第 3 列）和质粒 DNA（参见第 4 列）用量。

注：我们通常转染 d-siRNA 两倍量的质粒 DNA。

• 使用下表所列的推荐 Lipofectamine 2000 用量（参见第 6 列）作为起始实验用量，并针对细胞系对转染条件进行优化（如需要）。优化条件时，改变下表建议的 Lipofectamine 2000 用量（参见第 7 列）。

检测 ß-半乳糖苷酶的表达情况

如果您用 lacZ d-siRNA 对照进行 RNAi 分析，您可以用不含细胞的裂解物，通过 Western 印迹分析或活性检测方法检测 ß-半乳糖苷酶的表达和敲低效果 (Miller, 1972)。Invitrogen 提供的 ß-gal 抗血清（货号 R901-25）和 ß-Gal 检测试剂盒（货号 K1455-01）可以快速方便地检测 ß-半乳糖苷酶表达。有关 ß-半乳糖苷酶敲低实验所得结果的示例，请参见下文。

注：pcDNA™1.2/V5-GW/lacZ 对照质粒表达的 ß-半乳糖苷酶蛋白被融合至 V5 抗原决定簇，大小约为 119 kDa。如果您正在进行 Western 印迹分析，您也可以使用 Invitrogen 提供的抗 V5 抗体（如抗-V5-HRP 抗体；货号 R961-25；或抗-V5-AP 抗体，货号 R962-25）进行检测。

介绍

利用此部分信息解决剪切、纯化和转染实验中遇到的问题。
 
剪切反应

下表列举了进行剪切反应疑难解答时，一些潜在的问题及可能的解决方案。

转染和 RNAi 分析

下表列举了进行转染和敲低实验疑难解答时，一些潜在的问题及可能的解决方案

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