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The NovaFluor™ dyes from Phitonex are now a part of Thermo Fisher Scientific.The new dyes use novel technology to create cleaner fluorescent dyes.
フローサイトメトリーに最適な新しい蛍光色素
NovaFluor Dyeは、蛍光の漏れ込みやオーバーラップを最小限に抑えるようにデザインされた抗体用ラベリング色素です。励起範囲が狭く、シャープな蛍光スペクトルが得られるので、フローサイトメトリーで、利用できるマーカーの選択肢を増やすことができます。マルチカラーの免疫表現型解析などにNovaFluor Dyeを活用すれば、ハイレベルなパネル構築とマルチカラー解析が可能になります。
NovaFluor Dyeの特長：
- ユニークな構造により、シャープな蛍光スペクトルを提供
- 蛍光の漏れ込みやオーバーラップを最小限に低減
- 抗体量と蛍光量の相関性が高く、優れた定量性、ラベリング効率を発揮
- 4℃下で長期保存が可能
- ハイレベルなフローサイトメトリーのパネル構築に
NovaFluor Dyeの技術
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NovaFluor Dye は、1本鎖DNAを利用したPhiton™テクノロジーによって、蛍光色素の位置をデザインしています。たとえば、タンデム蛍光色素を構築する場合、ドナーとアクセプター分子間の距離を最適化できるので、従来問題となっていた蛍光の漏れ込みやオーバーラップの影響を最小限に抑えることができます。このユニークな特性により、従来は利用できなかった蛍光領域をマーカーとして追加し、ハイレベルなフローサイトメトリーのパネル構築とイムノフェノタイピングを実現します。
また、安定性に優れているNovaFluor Dyeは、染色や固定後4℃下で長期保存が可能です。
図2.Phiton技術による抗体ラベリング原理。タンデム蛍光色素の場合、DNA配列を利用してドナーとアクセプター分子間の距離を最適化することができます。また、抗体と色素が1対1で結合するので、使用する抗体量と蛍光量の相関性が高く、定量的な測定が可能です。また、抗体と色素が1対1で結合するので、使用する抗体量と蛍光量の相関性が高く、定量的な測定が可能です。
フローサイトメトリーにおけるNovaFluor Dyeの活用
NovaFluor Dyeは、単独で、または他の色素と併用して、フローサイトメトリーやイメージングアプリケーションで使用できます。NovaFluor Dyeは、複数のレーザーのチャンネルに漏れ込むような色素の代わりに利用することができます。たとえば、PE-eFluor 610 Dyeは、青と黄色のレーザーによって励起され、複数の検出器でオーバーラップしてシグナルが検出されます。このPE-eFluor 610 Dyeをシャープな蛍光スペクトルが特長のNovaFluor Blue 610とNovaFluor Yellow 610に置き換えると、2つの検出器を利用できるようになるので、マーカーを追加することが可能です。これにより、マルチカラー解析において、無駄なくハイレベルなパネル構築が可能になります。
NovaFluor Dyeは、PI、7AAD、DAPI、DyeCycle Dye、SYTOXなどの細胞膜非透過性の核酸染色色素とは互換性がないので、細胞の生死判定や生存率解析を行う際には、LIVE/DEAD Fixable dead cell stainsをご利用ください。
発現量が少ない抗原を探す場合などでは、分解能の高いシグナルを得るために、輝度の異なる色素を選択することがあります。図3は、NovaFluor Dyeを組み込むことで、マーカーを11カラーから13カラーに増やし、輝度の異なる色素を選択し、シグナルの漏れ込みを最小限にしたパネルの例です。
既存パネルのマーカーをNovaFluor Dyeに置き換える場合は、表1とexcitation/emission spectraをご参考ください。
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図3. Attune NxT Flow Cytometerのためにデザインしたパネルデザイン。NovaFluor Dyeを活用すると、従来の11カラーのパネルに（上表：Lagacy Panel = 11 colors）、2つのマーカーを追加し13カラーによるマルチカラー解析を実現します（下表：NovaFluor + Lagacy = 13 colors）。シグナルの漏れ込みのために、従来、使用できなかった検出チャネルを利用できるようになります。
最適な蛍光色素の選択
表1を参照して、実験に最適な蛍光色素を選択してください。色素の明るさは、「Separation index」の値を参照してください。例えば、発現量が少ない抗原を認識させる抗体をラベルする場合は、「Separation index」がより大きい値の色素を利用してください。また、複数の色素を用いる場合は、「Spread」の値がより小さい色素を選択し、漏れ込みの影響を最小限に抑えることが重要です。 （黄色 = 明るい色素、濃青色 = 暗い色素）
表1.NovaFluor Dyeと他の色素の比較。Fluorescent labels for flow cytometry, including spectral spread (calculated as the sum of spectral spread added to all non-primary channels) and separation index (as a measure of brightness, measured using anti-human CD4-SK3 for all fluorescent labels).All measurements were taken on a 5-laser Cytek Aurora.
| Fluorescent label | Excitation max (nm) | Emission max (nm) | Primary detector | Laser line | Spread | Separation index |
|---|---|---|---|---|---|---|
| NovaFluor Blue 510 | 496 | 511 | B1（498～518） | 488 | 727 | 55 |
| BB515 | 490 | 515 | B1（498～518） | 488 | 8430 | 255 |
| Alexa Fluor 488 | 495 | 519 | B2（516～533） | 488 | 2186 | 62 |
| FITC | 494 | 520 | B2（516～533） | 488 | 1856 | 31 |
| Kiravia Blue 520™ | 495 | 520 | B2（516～533） | 488 | 4294 | 114 |
| NovaFluor Blue 530 | 509 | 530 | B2（516～533） | 488 | 1128 | 12 |
| Spark Blue 550™ | 516 | 550 | B3（533～550） | 488 | 2065 | 31 |
| Alexa Fluor 532 | 532 | 554 | B3（533～550） | 488 | 834 | 8 |
| NovaFluor Blue 555 | 496 | 555 | B3（533～550） | 488 | 691 | 21 |
| NovaFluor Blue 585 | 494 | 585 | B4（571～590） | 488 | 1527 | 9 |
| NovaFluor Blue 610 / 30S | 509 | 614 | B6（605～625） | 488 | 2343 | 30 |
| NovaFluor Blue 610 / 70S | 509 | 614 | B6（605～625） | 488 | 3384 | 71 |
| NovaFluor Blue 660 / 40S | 509 | 665 | B7（652～669） | 488 | 3418 | 37 |
| NovaFluor Blue 660 / 120S | 509 | 665 | B7（652～669） | 488 | 5971 | 119 |
| PerCp | 482 | 678 | B8（669～687） | 488 | 1585 | 13 |
| PerCP-Cy5.5 | 482 | 695 | B9（688～707） | 488 | 4992 | 41 |
| PerCP Vio 700 | 482 | 704 | B9（688～707） | 488 | 5025 | 34 |
| PerCP-eFluor 710 | 482 | 710 | B10（707～727） | 488 | 13565 | 145 |
| NovaFluor Yellow 570 | 552 | 568 | YG1（567～587） | 561 | 1878 | 52 |
| PE | 496 | 578 | YG1（567～587） | 488; 561 | 11709 | 421 |
| CF® 568 | 562 | 583 | YG1（567～587） | 561 | 5504 | 181 |
| PE-Dazzle 594 | 566 | 610 | YG3（605～625） | 488; 561 | 13497 | 280 |
| NovaFluor Yellow 610 | 552 | 612 | YG3（605～625） | 561 | 4257 | 117 |
| NovaFluor Yellow 660 | 552 | 663 | YG4（652～669） | 561 | 6824 | 96 |
| PE-Cy5 | 496 | 667 | YG5（669～687） | 488; 561 | 41773 | 540 |
| NovaFluor Yellow 690 | 552 | 690 | YG6（687～706） | 561 | 3123 | 190 |
| PE-Cy5.5 | 482 | 695 | YG7（706～735） | 488; 561 | 22846 | 340 |
| NovaFluor Yellow 700 | 552 | 700 | YG7（706～735） | 561 | 3299 | 214 |
| NovaFluor Yellow 730 | 552 | 718 | YG7（706～735） | 561 | 5775 | 120 |
| PE-AF700 | 566 | 719 | YG7（706～735） | 488; 561 | 4549 | 82 |
| PE-Cy7 | 496 | 785 | YG9（765～795） | 488; 561 | 12059 | 352 |
| APC | 650 | 660 | R1（652～669） | 640 | 9844 | 231 |
| Alexa Fluor 647 | 650 | 668 | R2（669～687） | 640 | 10227 | 338 |
| NovaFluor Red 660 | 637 | 659 | R2（669～687） | 640 | 3789 | 192 |
| NovaFluor Red 685 | 637 | 685 | R3（688～707） | 640 | 3734 | 270 |
| Spark™ NIR 685 | 665 | 685 | R3（688～707） | 640 | 5369 | 176 |
| NovaFluor Red 700 | 639 | 700 | R3（688～707） | 640 | 3301 | 363 |
| APC-R700 | 652 | 704 | R4（707～727） | 640 | 9931 | 168 |
| NovaFluor Red 710 | 639 | 710 | R4（707～727） | 640 | 4256 | 108 |
| Alexa Fluor 700 | 702 | 723 | R4（707～727） | 640 | 2830 | 78 |
| APC-eFluor 780 | 633 | 780 | R7（772～795） | 640 | 3575 | 56 |
| APC-Cy7 | 650 | 785 | R7（772～795） | 640 | 5047 | 104 |
| APC/Fire™ 750 | 650 | 787 | R7（772～795） | 640 | 3967 | 71 |
APC/Fire, PE/Dazzle, Spark Blue, are trademarks trademarks of BioLegend,Inc.CF® is a registered trademark of Biotium.KIRAVIA Blue 520™ is a registered trademark of SONY Corporation.NovaBlue, NovaYellow, NovaRed, NovaFluor, are registered trademarks of Phitonex, Inc.
