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GeneArt® High-Order Genetic Assembly System
GeneArt® High-Order Genetic Assembly をご使用になれば、オーバーラップ領域があるPCRフラグメントに加え、末端が相同しない既存のDNAフラグメントを同時にシームレスにアセンブルできます。
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オリゴヌクレオチドステッチング
GeneArt® High-Order Genetic Assembly System独自のオリゴヌクレオチドステッチングにより、短い合成リンカーを使用して既存のDNAフラグメントの末端をつなぐことで、末端が相同でないDNAフラグメントをPCRを行うことなく正確にアセンブリるすることが可能です。
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どのように作用するか？
GeneArt® High-Order and Genetic Assemblyは、酵母がDNAフラグメントを高い効率で取り込み、組み替えることを利用しています 「形質転換依存的遺伝子組換え」というこのプロセスを使用することで、DNA操作が大幅に減り、制限酵素切断とライゲーションを行わずに、DNAフラグメントの正確なアセンブリが可能です。
GeneArt® Seamless Cloning and Assembly Kits work great together with GeneArt® Strings™ DNA Fragments. This new service offers custom-made DNA fragments up to 1,000 bp ready for cloning and assembly and delivered in only 5-7 business days.
) | 図2 3個のDNAフラグメントのアセンブリにこのシステムを使用しています。フラグメントの1つは、直鎖状クローニングベクターと末端相同性があります。 他のフラグメントはステッチングオリゴヌクレオチドを使用してアセンブルします。 |
) | アセンブルした最終的なコンストラクトを含む「ポジティブ」クローンを選別し、コンストラクトを大腸菌に移し、プラスミドを大量に生産し、ダウンストリームのアプリケーションに使用します。 |
High-Order DNA Assemblyのプロトコール
- 直鎖状クローニングベクター（pYES1Lまたはその他の酵母用ベクター）とアセンブルしたいDNAフラグメントをてチューブに入れます。 非相同のDNAフラグメントをアセンブルする場合には、同じチューブにステッチングオリゴヌクレオチドも加えます。
We highly recommend using our web-based tool to confirm end-terminal homology between adjacent DNA fragments, check for potential homologous regions in the fragments that could lead to undesired recombination, and/or to design PCR primers and stitching oligonucleotides. - 直鎖状クローニングベクターとDNAフラグメントをMaV203コンピテント酵母細胞（システムに含まれています）に導入します。 DNAを導入された酵母をCSM-Trpアガーにプレーティングし、3日間インキュベートします。
- コロニーPCRを行い、アセンブルしたDNA分子を含むポジティブクローンをスクリーニングします アセンブルしたDNA分子を大腸菌に移すために、1つ以上のポジティブコロニーを単離します。
- キットに含まれる専用バッファーとビーズを用いてポジティブコロニーのライセートを調製し、アセンブルしたDNA分子をOne Shot® TOP10 Electrocomp™ E. coli（システムに含まれています）に導入し、プラスミドを大量に調製し、ダウンストリームの実験に使用します。
これまでにない精度と効率
GeneArt® High-Order Genetic Assembly System を使用することにより、広範囲のサイズ、数のフラグメントを効率的にクローニングできます。DNAフラグメントのアセンブリは高精度で、余分な塩基を付加することなく行えます。
) | 図 3: PCRで増幅した10 kbpのフラグメントのクローニング効率（フラグメント数別） 図3は、Platinum® PCR SuperMix High Fidelityで増幅した各10 kbpのDNAフラグメント1、3、10個がpYES1Lに高い効率でクローニングされること示しています。 コンストラクトを大腸菌に移し、DNA挿入部位のシーケンシングを行って正確さを確認しました。 |
) | 図 4:GeneArt® Seamless Cloning and Assembly KitとGeneArt® High-Order Genetic Assembly Systemのクローニング効率を比較 各5 kbの10個のフラグメントをpYES1L内でアセンブルしたときのクローニング効率は90%を超えました。 フラグメントをPlatinum® PCR SuperMix High Fidelityで増幅し、GeneArt® High-Order Genetic Assembly Systemを使用してpYES1L内でアセンブルしたとき、クローニング効率は90%を超えます。 |
DNA Oligo Designerは、目的のDNA分子をデザインするときに役立つ直観的なウェブベースのツールです。 このツールを用いることにより、実験計画に要する時間を最小限に短縮でき、問題となりそうな点を特定でき、またin silicoでクローニングを行えます。 DNA Oligo Designerでは、アセンブルした最終分子をグラフィック表示できるほか、Vector NTI Advance®や他の分子生物学ワークフロー用ソフトウェアに適合するダウンロード可能なGenBankファイルも作成できます。
また、注文を簡単に行えるように、一部地域では必要なDNAオリグヌクレオチドをDNA Oligo Designerから直接ショッピングカートに入れる機能をご利用いただけます。
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.