NCode™よくある質問(FAQ)

For answers to additional questions, contact Life Technologies Technical Support to have a representative assist you.

What is the lowest amount of sample needed to use the NCode™ Rapid miRNA labeling system and array?
When using the NCode™ Amplification Kit, at least 50 ng of total RNA is needed to run one slide in a single color. NCode™ Amplification キットを使用しない場合、１色の1スライドまたは異なる色の2スライド（色素交換）につき、約250ng - 5μgのトータルRNAサンプル量が必要です。

注: スタートサンプル量が250 ngを下回る場合、 NCode™ Amplification キットの使用をおすすめします。 スタートサンプル量が500 ngを下回る場合は、増幅は不要ですが、発現レベルが低いmiRNAsの研究においては複製するのが好ましい場合があることを考慮する必要があります。
For the original NCode™ miRNA Labeling system, 10 µg of total RNA (or equivalent cells or tissue) was recommended and yields approximately 200 -600 ng of small RNA, depending on the sample.

The protocol for theNCode™ Rapid miRNA labeling system indicates total RNA should be used as starting material. Will I obtain better results if miRNA is used?
We recommend using total RNA as starting material. 濃縮されたmiRNAよりもトータルRNAを使用した方がより感度が高い結果がでています。カラム精製段階でみられることがある材料のロスによるのかもしれません。

How do I recover the large RNA fraction from the Purelink™ miRNA Isolation Kit after isolating the small RNAs?
In most cases, total RNA should be used with the NCode™ Rapid miRNA System. インビトロジェン テクニカル サポートに問い合わせてくださいスタッフがプロトコール作業のガイドを提供します。

Does the isolated RNA fraction contain a mixed population of mature and precursor miRNA ?
The isolated small RNA fraction may contain precursor miRNAs; circumstantial evidence, however, suggests that this may not be the case. 以下の観察が役に立ちます。
A. miRNA前駆体が非常に急速にターンオーバーしていることと既存の論文は一致しています。　 ラベルされていたとしても、シグナルへの寄与は無視できるでしょう。
B.成熟miRNAがラベルされた時にのみ予想されるように、アレイにプリントされた複数のmiRNAの反対配列がライトアップされません。
C.前駆体miRNAステムループ領域にqRT-PCR用プライマーを設計しました。少なくとも5-6Ct 後ろに見られました。

Which protocol should I use to enrich for miRNA?
If you are enriching for LMW RNA using the PureLink™ miRNA Isolation Kit, we recommend enriching from total RNA as opposed to cells or tissue. PureLink™ miRNA Isolation キットマニュアルには、TRIzol® 試薬を使用してトータルRNA分離から開始するサンプル量が多いもの用のプロトコールが含まれています。 We recommend using this protocol in NCode™ labeling applications, even if you are not starting with large sample amounts.

What does Invitrogen suggest using to isolate RNA from blood or serum samples?
NCode™ Rapid miRNA ラベリングシステムは、miRNA 濃縮の必要がありませんので、通常、低分子RNAは精製時にも残るので、トータルRNA分離用のTRIzol®をおすすめします。 TRIzol® LS というTRIzol® 試薬を液体サンプル用に改変したものがあります。

When do I normalize my samples prior to labeling?
We recommend normalizing the samples at the tissue level or the total RNA level (gram for gram), prior to miRNA enrichment. サンプルにmiRNAまたは分解RNAが多く含まれている場合、miRNAレベルでノーマライズすることで測定結果は変わってくる可能性があります。

Is it necessary to do a dye-swap with Invitrogen’s labeling technology?
We recommend running each sample with both dyes. これによりサンプル分析の際にいかなる色素バイアスも減少できる可能性があります。

サンプル／アレイは1日当りどれだけ処理できますか。 How many people do I need?
The number of samples that can be processed in a single day depends on the equipment and scientists available. 通常、サンプル調製時間と分析を含め、1人あたり1週間に48マイクロアレイの実施が可能です。

インビトロジェンではmiRNAプロファイリングに基づく植物用の製品を供給しますか。
現在のところ提供しておりません。 植物miRNAのプローブは、現在のNCode™ miRNAマイクロアレイには存在しません。

Do you have to use RNAase free reagents with the NCode™ miRNA labeling kits?
It would be safest to use RNAse free reagents, preferably those provided with the kit.

Are the NCode™ miRNA arrays designed to do single labeling (two cell populations are hybridized separately and then superimposed to identify differences) or dual labeling (miRNA from two cell populations are hybridized to the plate at the same time)?
The arrays can be used for dual labeling by attaching different fluorophores (Alexa Fluor® 3 or 5 ) to each of the two samples populations. Ncode™ Profiler can then be used for analyzing the data.
単色標識が利用される場合は、Ncode™ Profiler は現在これには対応していません。 削除 Data Analysisの関連FAQをご参照ください。

What are good stopping points in the NCode™ miRNA labeling kits?
The following stop points seem to work fine without compromising the overall protocol:

1. タグのついたmiRNA（PAP反応後、キャップ配列に連結されたもの）は-20Cで保存できます。
2. オリジナルのNCode™ラベリングシステム用のみ： タグ付きmiRNAの最初のハイブリダイゼーションおよび洗浄を行った後、乾燥させたスライドは48時間まで室温で保存できます。

Do the NCode™ miRNA labeling kits exhibit dye bias (green dye labels better than the red dye)?
Under the same experimental conditions, the two dyes should be labeled to the same extent with no obvious bias. ですが、赤染色(Alexa 5)は緑染色(Alexa 3)に比べ若干、光退色しやすい傾向にあります。 色素を光にさらさないよう十分注意してください。 赤と緑のチャンネルから同強度のシグナルを得るには、PMT（光電子倍増管）ゲインセッティングのノーマライズとプレスキャンを行うことが望ましいです。 これにより色素バイアスの影響を削減できます。 ダイスワップ実験関連のFAQを参照してください。

What types of scanners are compatible with the NCode™ Microarrays?
The NCode™ miRNA Microarrays may be scanned using a standard digital microarray scanner with a resolution of at least 16 bits/pixel. 詳細はマイクロアレイスキャナーを参照してください。

What exactly is needed to scan the array?
-A standard digital microarray scanner. 当社では、ビット深度が最小16 ビット/ピクセルのスキャナーでスキャンすることを推奨します。
The GenePix® 400B (Molecular Devices) has been tested with the NCode™ microarrays, and includes GenePix® software for analyzing the scanned image.
-Microarray acquisition and analysis software, such as the GenePix® Pro (Molecular Devices) or ScanArrays® Express (PerkinElmer, Inc.)

What are the overall dimensions and X & Y spot coordinates for the array?
The NCode™ Multi-Species miRNA Microarray V2 has the following specifications. クリックしてアレイのレイアウトの詳細を表示してください。

• 基質: Corning® Epoxide –Coated Glass Slides
• プリント方法: microquillピンを使用してコンタクトをプリント
• 1スライドあたりのトータルサブアレイ: 3
• サブアレイレイアウト: 8 ブロック（4 列 × 2 段)
• ブロックレイアウト: 192 スポット（12列 × 16段）
• ブロック寸法: 4 mm × 3 mm
• スポット平均直径: 120 μm
• 中心間距離をスポット: 265 μm
• プローブ: 修飾されていないオリゴヌクレオチド、長さ34–44 bases

Can precursor miRNAs be detected on the array?
Precursor miRNAs have a very rapid turnover in the cell and will most likely not be detected by the NCode™ miRNA Microarrays.

What is the exact nature of the controls for the NCode™ Multi-Species miRNA Microarray?
Dye normalization control: Alexa Fluor® Dye Control Probesは、V2アレイにおける濃度幅内にプリントされ、2つのキャプチャー試料間の蛍光シグナル強度差をノーマライズできるようになっています。 The NCode™ Human miRNA Microarray also contains controls for dye normalization.

NCode™ Rapid miRNA ラベリングシステムにとって、NCode™ Dye Normalization Controlは、ライゲーション・ミックス内のオリゴ（dT）ブリッジに似た合成オリゴヌクレオチドです。 これには、テイルの付いたRNAに相補的な塩基代わりに、NCode™ Multi-Species miRNA MicroarrayのAlexa Fluor® Dye Control Probesに相補的な塩基が含まれています。 ライゲーション・ミックス内の色素標識されたDNAポリマーを Dye Control Probesに結合するよう設計されており、2つのAlexa Fluor®色素間の蛍光シグナル強度の差をノーマライズします。

Positive Control： NCode™ Multi-Species miRNA Microarray Control V2 は、NCode™ Multi-Species miRNA Microarrayシステムに使用するためのポジティブコントロールとして設計された合成 22-ヌクレオチド miRNA 配列で、アレイじゅうにスポットされています。 このコントロールと、NCode™ miRNA ラベリングシステム、 NCode™マイクロアレイ、アレイ標識とハイブリダイゼーションの効果を調べるプローブセットを併用してください。

What is the concentration of the NCode™ Multi-Species miRNA Microarray Control V2?
NCode™ Multi-Species miRNA Microarray Control V2 is provided at a concentration of 2 pmol/μL in a volume of 10 μL.

Are the control probes on the NCode™ Multi-Species miRNA Microarray V2 spotted in the same concentration?
The NCode™ Control probe is spotted at the same concentration throughout the array; however, the dye normalization control probes are printed in a range of concentrations.

What are the probes used to design the NCode multi-species miRNA microarray V2?
The NCode™ Multi-Species miRNA Microarray V2 consists of oligonucleotides complementary to known miRNA sequences for human, mouse, rat, D. melanogaster, C. elegans, and Zebrafish. These species-specific, unmodified oligonucleotides are designed from the miRNA sequences in the Sanger miRBase Sequence Database, Release 9.0. The array also includes probes for some small nucleolar RNAs. 各miRNAプローブは、タンデムリピートとして合成され、3重にスポットされています。 このマイクロアレイには、内在性miRNAと交差反応しないように設計されたユニークなmiRNAシークエンス用のコントロールプローブもスポットされています。 In addition, there is a dye control printed in a range of concentrations from high to low, to allow for dye normalization during scanning.
NCode™ Human miRNA Microarray V3 には、miRBase Sequence Databaseのヒト用のRElease 10.0内の既知の成熟miRNAに最適化されたプローブが含まれています。 さらに、deep sequencingで発見され、アレイ/qRT-PCRで生物学的にバリデートされた373 新しいヒト用 miRNA対応のプローブがあります。 V2アレイにもあるミスマッチおよび色素ノーマライゼーションコントロールに加え、核小体低分子RNA（sonRNA）用のプローブもあります。


What is the citation through which the NCode miRNA probe design was introduced?
Goff, L. A., Yang, M., Bowers, J., Getts, R. C., Padgett, R. W., and Hart, R. P. Rational Probe Optimization and Enhanced Detection Strategy for MicroRNAs Using Microarrays. RNA Biology, 2005; 2(3) 93-100.

Why are the probes in the NCode miRNA probe set 40-44 bases long while the mature miRNAs are only 20-22 bases?
The probe set oligos are mature miRNAs synthesized as tandem repeats, so the same sequence is present in two adjacent copies (total length 40-44 bases). シグナル増強に役立ちます。

What is the dynamic range of the NCode™ Multi-Species miRNA Microarray?
When starting with 10 ug of total RNA for miRNA enrichment for the original labeling system,, we were able to detect down to 0.3 fmol (corresponding to hundreds of copies) with static hybridization. Incubation in the MAUI hybridization station further improves the detection sensitivity. miRNAの濃縮度が高過ぎるため、検出器を飽和するケースには至っていません。

When starting with 500 ng -5 ug total RNA for the NCode Rapid miRNA labeling system, we were able to detect attamolar levels of miRNA corresponding to 2-10 copies per cell with the the MAUI hybridization station. 少量のトータルRNAでスタートできますが（100ngまでテスト済）、スタート材料が少ないと低発現量のmiRNAは喪失する可能性がある点にご注意ください。

Does the NCode Multi-Species miRNA Microarray have to be blocked before hybridization?
Unprinted areas of the microarray are fully blocked to reduce background fluorescence. さらにブロッキング作業を行う必要はありません。

Can the NCode microarray slides be left in wash solution 3 prior to centrifugation?
Yes, as long as the slides are not exposed directly to air.

What is recommended for drying the arrays?
With the NCode™ Rapid miRNA labeling system, centrifugation or compressed air may be used for drying, though centrifugation is recommended.

オリジナル標識システムにおいて、圧縮空気ではなく遠心分離でスライドを乾燥することが重要です。 さらに、空気乾燥を避けるため、スライドは洗った後、即座に遠心分離機に設置しなければなりません。 スライドを遠心分離機に移す必要がある場合は、遠心分離機に完全に設置するまでウォッシュバッファーで保存してください。 空気や圧縮空気による乾燥は、ストリーキングやハイバックグラウンドの原因になります。 スライドラックには、推奨回転速度600 X gで遠心でき、マイクロタイタープレート・ローター・アダプターの付いた遠心分離機の使用を推奨します。 空気乾燥させた場合、ウォッシュバッファーが緑のバックグラウンドシグナルを出す傾向にあります。

How do I reduce Cy5 or Alexa 647 fading?
Cy5 and Alexa 647 dye performance may be affected by a variety of factors that are particularly prevalent during the summer months. これらの色素溶液やハイブリダイズされたアレイが光や酸化環境下にさらされると、標識システムにかかわらず直ぐに退色する可能性があります。 こういった環境にアレイをさらすことを制限し調節することが、退色を大幅に減らすと示されています。 以下に推奨することが退色の減少に役立ちます。

• Cy5を含むアレイと溶液は常に、通常の蛍光灯も含め光にさらされないようにしてください。
• プラスチックカバースリップまたはプラスチック部分がご自身のハイブリダイゼーションミックスと接触するハイブリダイゼーションチャンバーは、使用しないでください。 染色試薬の分注にはアンバーチューブは使用しないでください-コーティング剤が染色試薬に反応することがございます。
• すべてのキャプチャー試料は、使用前に、プロトコルに従い適切な準備（解凍、混合、加熱）ができているか確認してください。

What is the recommended PMT and laser intensity setting for scanning the NCode™ miRNA Microarray?
Most commercially available scanners are compatible with the NCode arrays. The intensity of the signal will vary from scanner to scanner because of differences between the hardware (lasers, filters, etc.) used by each manufacturer. スキャニングする前に、ご使用の推奨されたレーザーとPMTセッティッング対応のスキャナーのユーザーマニュアルをお読みください。

NCode™ GALファイルはロットに特異的ですか。 Can the same GAL file be used for different lots?
No, the NCode™ Multi-Species miRNA Microarray V2 and the NCode™ Human miRNA Microarray V3 GAL files are not lot specific. 初期のNCode™ Multi-Species miRNA Microarrayのバージョン(V1)のGALファイルについては、ロット特異的です。

GALファイルとは正確にはどのようなものですか。
このアレイ用のGAL (GenePix® Array List) ファイルは、タブ区切りのテキストファイルで、 NCode™ miRNAマイクロアレイのプローブの位置、名前、プローブIDを含んでいます。 MultiSpecies V2 arrayには、このアレイの個々の種用に複数のGALファイル（複数）、また、このアレイ全体用の一つのGALファイルがあります。 GenePix® ProとScan Array®を含むほとんどの主要なマイクロアレイソフトウェアは、GALファイルの情報とスキャンしたアレイのデータを組み合わせ、対象実験におけるすべてのデータから結果ファイルを得ることができます。
註： ご自身のソフトウェアがGALフォーマットのファイルを受け付けない場合、 Microsoft® Excel といったスプレッドシートプログラム内のファイルを開き、対応するconfigurationで情報を再度フォーマットするか、手動でスポット強度データと比較してください。 ご自身のマイクロアレイ分析ソフトウェアについてよく調べてください。


What are the differences between the NCode™ Multi-species miRNA Microarray Kit V2 and the earlier NCode™ Multi-Species miRNA Microarray V1?
違いは3点あります。

• 初期のV1アレイには、Sanger miRBaseデータベースのバージョン7.0にリストされたすべてのmiRNAに対するプローブがあり、予測ヒトmiRNAが含まれていました。 NCode ™ Multi-species miRNA MicroarrayキットV2はバージョン9.0に基づいており、予測ヒトmiRNAはいっさい含んでいません。
• NCode ™ Multi-species miRNA マイクロアレイV1は２つの複製サブアレイがレイアウトされていましたが、v2は３つの複製サブアレイとしてレイアウトされています。
• NCode ™ Multi-species miRNA MicroarrayキットＶ2には、スキャン中にシグナル強度の簡単なノーマライゼーション行うことができるAlexa Fluor® Dye Controlプローブが含まれます（V1にはこれは含まれていません）。

どのハイブリダイゼーションがベストですか。
静的ハイブリダイゼーションは、問題はありませんがダイナミック混合システムほどの感度はありません。 We use the MAUI hybridization system and this gives approximately 10x better sensitivity than the static method. AgilentかMiltenyiチャンバーを使用することもできます。

What protocol is used for the MAUI hybridization system?
ラベリングの標準プロトコルおよび、弊社のラベリング・キット・マニュアルで推奨されているハイブリダイゼーションバッファーを使用します。 SLミキサーを使用し、47uLをロードします。 We mix in mode A.

Is a specific hybridization oven recommended?
We prefer using an oven over a water bath for static hybridizations because the water bath can be quite dirty. どちらも正常に機能しますが…。 光プルーフであれば、たいていどのハイブリダイゼーションオーブンも問題ありません。

マニュアルで推奨されているCorningのハイブリダイゼーション用チャンバーおよびLifterSlip以外で、システムと互換性のあるその他のスライドやカバースリップがありますか。
Yes, Fisher sells coverslips (LifterSlip Cover slips for Microarray Slides) that will work.
また、Monterey Industriesからハイブリチャンバーもでています。こちらも機能すると伺っています。

アレイのグリッドごとに差が生ずる原因は何ですか。
カバースリップにエアーバブルがないか確認してください。 また、デンドリマーをマニュアル通りに扱っているか確認してください。 デンドリマーが凝集しているとシグナルにばらつきがでる場合があります。 ご使用のカバースリップによってもばらつきが生じます。 25x60スリップを使用した場合、ばらつきが少ないようです。 狭すぎたり短すぎると均一なカバレッジが得られません。 リフタースリップの境界は、アレイからできる限り離れている必要があります。
ウォッシュ管は大きい方が好ましいです。 我々のウォッシュ管はウォッシュバッファー500ml 程度です。
全体的に、通常、ばらつきはアレイ表面の不均等なハイブリダイゼーションにより生じます。 これは、混合デバイスを使用したときよりも、静的ハイブリダイゼーションが実施された場合に多く聞かれます。

What is a loop experiment?
The loop design model allows for each sample to be compared to each other sample. 異なる手段でハイブリダイズされたサンプルがあると、統計学的特徴でなされた比較物の量を制限できます。 NCode™ miRNA Microarray 実験に設計されたループについての詳しい情報は、 Experimental Planningをご参照ください。

What software is recommended for analysis of the NCode™ miRNA Microarray data?
Any analysis software associated with the scanner should be fine. 詳しくは Experimental Planningをご参照ください Invitrogenは、NCode™ Profilerというダウンロードが可能なフリーソフトウェアプログラムをリリースしています。

単一カラー標識を選ぶとすると、データ分析はどのようにしますか。
現在、NCode™ Profilerは、単色分析には対応していません。 単色分析におけるアドバイスは以下の通りです。
1. GeneSpring can be used for this type of analysis. データのノーマライズに使用できるフリーウェアがあります。http://www.tm4.org/midas.html できれば別チップのtechnical replicatesを強く推奨します。
2. We recommend first normalizing values globally across a chip to the median value and secondly normalizing per gene across chips.
3. You can then use these normalized values to assess statistical significance of fold change, make heat maps and Venn diagrams.

How do I make a standard curve for quantitative determination of miRNA?
Researchers studying miRNA expression levels are usually looking for comparative quantification instead of absolute quantification. スタンダードカーブを用いる目的は以下の通りです。

• miRNAプライマーセットの効率を確認する
• qPCR条件を確認する
• R²値をチェックする
• アッセイのダイナミックレンジ（または、特定の条件下で効率よく同定できるテンプレート最大量または最小量）を見極める

これを達成するためには、理想的には未知のmiRNAが対象とする同じサンプルからのtotal RNAの希釈系列を行います。 極めて高い濃度から極めて低い濃度へ希釈します。効率に影響を及ぼすようであれば、スタンダードカーブのポイントはいつでも取り除くことができます。 テンプレートの範囲がいったん 90-110%の効率内になれば、実際の実験用サンプルアッセイのスタンダードカーブ中のいかなる量のトータルRNAも使用できます。 別のスタンダードカーブは、対象のmiRNA用とノーマライザーRNA用に作らなければなりません。

What type of RNA internal standards are there for quantitative determination of miRNA?
The most common normalizer options for miRNA quantitation have been U6 snRNA and 5S rRNA. もちろん、どのqPCR反応でも、発現の一貫性を事前に確認しなければなりません。 We typically use traditional housekeeping genes such as GAPDH or B2M for normalization, once we have confirmed expression is similar across the samples being studied. miRNAs or snRNAs can be used but only if it is confirmed that expression does not change across all of the samples. すべての場合に使用できる万能なmiRNAやsnRNAはありません。 下の表がハウスキーピング遺伝子に使用した配列です。

Does the NCode SYBR Green miRNA qPCR kit require isolation of miRNA for detection and quantification of miRNA ?
No, miRNA isolation is not required. これらのキットは、 miRNA特異的フォアワードプライマーとユニバーサルqPCRプライマーを使用したトータルRNAの 10 ngから2.5 μgのmiRNAの検出に最適化されています。

What is the sequence of the universal primer contained in the NCode™ miRNA qPCR kit?
The sequence of the universal primer is proprietary, and is not disclosed.

How should I design the miRNA qRT-PCR primer to be used with the NCode™system?
Invitrogenは、アレイで各miRNAのために使用するプライマー配列をすでにデザインしています。 これらはNCode™データベース内に構築されています。

プライマーの Tm は、以下の参考文献に基づき、近似計算法で算出しました。
John SantaLucia, Jr. Hatim T. Allawi, and P. Ananda Seneviratne. Improved Nearest-Neighbor Parameters for Predicting DNA Duplex Stability. Biochemistry 1996, 35:3555-62

If you are designing a primer for a unique or novel small RNA, please consider the information below.
The optimal Tm range is 58-65. Tmが58を下回る配列は、"A"を加えてTmを増加させるか、修飾塩基で置換してみることもできます。 ひとつの配列に、6を上回る"A"を加えないでください。 デザインされたプライマーの長さは最長でも 30 ヌクレオチドです。 For sequences with calculated Tm greater than 65, bases were truncated from the sequence and the resulting primer should be at least an 18mer match to the target. ほとんどの場合、該当塩基は 3' 末端から切断されますが、独立して定量されているファミリーメンバーに近似している場合は、最適の位置で切断するよう十分注意を払ってください。

NCode™ qRT-PCRシステムの特長は何ですか。
NCode™ First strand cDNA合成システムでは、インプットサンプルに存在するすべてのRNA種から生成される万能な"universal" cDNAの生成が可能です。 このことが、ハウスキーピング遺伝子または別のノーマライザーを同じサンプル内で増幅することを可能にします。 このcDNAは、後で用いるために、他の低分子RNA分析用に、保存することもできます。 これはサンプルが貴重な時には必須ですが、miRNA特異的qRT-PCRアッセイではできません。

スタンダードカスタムオリゴはqPCR段階で使用されるので、一般にこのシステムは他の方法に比べ費用がかかりません。 プライマー用の一般デザインガイドラインを提供しています。バリデートされたmiRNA特異的なアッセイがない新しいmiRNAや他の低分子RNAのデザインや検出が可能です。

How should I design the miRNA qRT-PCR primer to be used with the NCode™ system?
Invitrogen has already designed primer sequences that you may use for each miRNA on our arrays. これらはNCode™データベース内に構築されています。 プライマーのTmは、以下の参考文献を基に、近似計算法で算出しました。

John SantaLucia, Jr. Hatim T. Allawi, and P. Ananda Seneviratne. Improved Nearest-Neighbor Parameters for Predicting DNA Duplex Stability. Biochemistry 1996, 35:3555-62.

ユニークなまたは新規の低分子ＲＮＡ用のプライマーをデザインする場合は、以下の情報を参照してください。

最適Tm範囲は58–64°Cです。 Tmが58°Cを下回る配列には、"A"を加えてTmを増加させるか、修飾塩基で代用してみることもできます。 ひとつの配列に、6を上回る"A"を加えないでください。 それでもまだTm内の増加が必要なら、GC残基を 5’末端に追加することもできます。 デザインされたプライマーの長さは最長でも 30 ヌクレオチドです。 Tmが64°Cを上回る配列には、5’末端から塩基を切断しますが、プライマーの長さはターゲットに一致する18-mer以上でなければなりません。 ほとんどの場合、該当塩基は 3' 末端から切断されますが、独立して定量されているファミリーメンバーに近似している場合は、最適の位置で切断するよう十分注意を払ってください。

What are the differences between the original NCode™ miRNA first-strand synthesis and qRTPCR kits and the newer versions incorporating the SuperScript® VILO™ cDNA Synthesis Kit and EXPRESS SYBR® GreenER™ dye?
There are quite a few changes in the newer kits as compared to the previous version. まず、作業の流れがすっきりし、ポリアデニル化と逆転写組合せステップが注意深く最適化されています。 そして、ユニバーサルRTプライマーが再デザインされています。 従って、別のユニバーサルqPCRプライマーが、以前のバージョンよりも新しいフォームレーションで生成されたcDNAに必要です。 また、最新のInvitrogen酵素が反応ミックスに追加されました。 the SuperScript® VILO™ cDNA Synthesis Kit, which provides the most reliable first-strand synthesis and higher cDNA yields, and the newest SYBR® GreenER™ dye, now specifically tailored to deliver superior results on high-throughput, fast-cycling instruments.

total RNAの品質を評価するには、どの方法を使用すべきですか?

Superscript Indirect RNA Amplification Systemを使用してcRNAターゲットを合成するには、どれだけの量の開始材料が必要ですか?
反応あたりの開始材料 (total RNA)を0.5 µg～1.0 µg使用することをお勧めします。

SuperScript® Plus Indirect (またはDirect) cDNA Labeling System with Alexa Fluor DyesでcDNAターゲットを準備している場合、どれだけの量の開始材料が必要ですか?
少なくとも、1反応あたり5.0 µgの開始材料(total RNA)を使用するようにお勧めします。

Agilent RNA Spike-In Mixは、どのようにして準備したらいいのですか?
シングルカラー: One Color RNA Spike-in Kit Protocol (5188-5977)
Dual color: Two Color RNA Spike-in Kit Protocol (5188-5928)

What volume of the diluted RNA Spike-In Mix do I add to each reaction?

Why is DTT used in the first strand synthesis reaction?
This is required by the enzyme for optimal efficiency.

Why is E. coli DNA ligase used in during second strand synthesis?
After the first strand is synthesized, DNA Pol I will use the fragmented RNA template as primer for the second strand replacement synthesis. The E. coli DNA Ligase is used to fill any gaps or nicks caused by RNase H.

How long can ds cDNA be stored at -20°C?
Indefinitely

Is the DNase I treatment optional?
Yes, it is optional.

What is the minimum/maximum time required for the in vitro transcription reaction?
Recommended time is between 4 and 14 hrs. 4-6時間あれば、ほとんどのマイクロアレイアプリケーションに十分量のcRNAが生成されます。 インキュベーション時間を延ばすと、収量が増大します。

Should I use DEPC-treated water or RNase/DNase-Free water?
Both are acceptable.

500ngのtotal RNAから開始するとき、予想されるcRNAの収量はどれくらいですか?
The expected yield from 500ng of HeLa control RNA is >20 µg

Are there any places within the protocol to stop if needed?
The sample may be stored after second strand cDNA synthesis is complete.

Should I use single or dual color labeling?
Both single color and dual color labeling are supported. 実験デザイン、サンプルサイズ、データ解析モデル、処理機能はどのラベリング方法が最適化を決定するときに慎重に考慮する必要がある要因です。

シングルラベリングでは用途が最大限に広がり、ダウンストリーム解析も容易になります。 このアプローチでは、Alexa Fluor 555またはCy3を使用してください。 Recommended

Dual color is applicable when measuring the relative expression levels between 2 samples or conditions (e.g. cell line A vs. cell line B). リファレンスまたはループモデルデザインが一般に使用されます。 通常、Dyeスワップが含まれますが、オプションです。

各条件に対してどれだけの数のBiological Replicateが必要になりますか? Technical replicates?
We highly recommend using a minimum of 3 biological replicates per condition in your experiment.

Can I store my labeled cRNA overnight before hybridizing to the array?
You may store the labeled cRNA in the dark at -80°C.

What size cRNA fragments should I expect to see after the fragmentation step?
The typical size range for fragmented cRNA is between 50 and 200nt.

Which target preparation method do you recommend?
Generating labeled cRNA targets via the Superscript Indirect RNA Amplification System (or equivalent)

How much of the labeled cRNA target is used in the hybridization reaction? Answered in FAQ
Single color: 1.5ug per sample
Dual color: 1.5ug per dye

What result can I expect if I use slightly degraded RNA?
The recommended RNA amplification protocol uses a T7-poly(dT) primer for first strand cDNA synthesis. この中間テンプレートは、その後cRNAに増幅されます。 分解したRNAを使用すると、かなり短いcRNA製品ができるため、3’のエンドバイアスが伸びることになります。 結果としてでるデータは、サンプルの真の発現レベルを反映しない場合もあります。

How do I use the files contained on the CD?
The included insert contains more information on how to use the files.

互換性のあるのは、どのマイクロアレイスキャナーですか?

• Agilent Technologies DNA Microarray Scanner Model#G2565BA
• Agilent Technologies DNA Microarray Scanner Model#G2565CA
• Axon GenePix® 4400A
• Axon GenePix® 4300A
• Axon GenePix® 4200A/AL
• Axon GenePix® 4000B
• Axon GenePix® 4100A
• ArrayIt InnoScan 900シリーズ
• PerkinElmer® ScanArray®
• PerkinElmer® ProScanArray®

互換性があるのは、AgilentnoFeature Extractionソフトウェアのどのバージョンですか?
Files have been tested using Feature Extraction Software Version 9.5, but should also work with FE Version 8.5 through 10.1.1

Is the NCode miRNA Rapid Labeling System compatible with the non-coding array?
No, the NCode miRNA Rapid Labeling System is NOT compatible with the Non-coding RNA array.