dPCRデータ発表のためのdMIQEガイドラインについて

ポアソン分布モデルでは、ターゲット分子はマイクロ反応間でランダムかつ独立に分布していると仮定しています。ポアソン分布は、サンプルあたりのマイクロ反応が多くなるほどターゲット分子の真の分布の妥当な近似になります（dMIQE Group,、2020年）。これに関連して、反応数が増えるにつれて、観測される頻度（ターゲット分子のポジティブマイクロチャンバーの数）が真の確率（ターゲット分子を含む反応の確率）に収束するという「大数の法則」が作用します。反応数が多いと、研究者にとって以下のような利点があります：

1. 統計の信頼性の向上：マイクロ反応数が多いほど、ターゲットに対してポジティブの反応が多くなる可能性が高くなります。これにより、ターゲット濃度の定量における統計的信頼性が向上します。
2. サンプルをより適切に説明：より多くのマイクロ反応とサンプル量検査の向上（デジタルプーリングテクニカルノートを参照）の組み合わせは、サンプル中のターゲット分子のランダムサンプリングを向上させ、結果は実際のターゲット濃度をより正確に示すものになります。また、サンプリングエラーを低減できるため、はずれ値の定量への影響が小さくなります。
3. 感度と精度の向上：dPCRの統計的検出力は、マイクロ反応数が増えるにつれて高くなり、ターゲット濃度が低い場合でも正確な定量を可能にします

重要：マイクロ反応数がより多いと、不確実性の影響を最小限に抑えることで「真の値に近づくこと」ができます。

さらに、dMIQEガイドラインの図（図1）は興味深い洞察を示しています。λの95%信頼限界のモデル化に基づいて、1万のマイクロ反応点での相対的不確実性経験が大幅に向上することがわかりました。この点を超えると、相対的な不確実性の改善は依然として明らかですが、より緩やかな傾向が見られます。この変移を理解することは、研究者が研究に必要なダイナミック レンジに基づいてdPCR実験を最適化するのに役立ちます。

dPCR装置が各マイクロ反応において等しい量を提供するという要件は、dPCRによる定量が正確で高精度であることを確保するために重要です (The dMIQE Group、2020)。マイクロ反応で量を等しく保つことは、次のようないくつかの理由で不可欠です：

1. ポアソン統計モデル：dPCRにおけるターゲット分子の定量はポアソン統計モデルに依存しています。このモデルが成り立つためには、各反応が1つのターゲット分子を含むか、空であるかの確率が等しくなければなりません。反応量が逸脱するとターゲット分子の分布にバイアスが生じ、不正確な定量結果につながる可能性があります。
2. 全体的な精度：反応量が等しいことで、dPCR定量の正確性が向上します。ポアソン統計モデルでは、マイクロ反応あたりのターゲット分子数の分散が平均と等しいと仮定しています。すべてのマイクロ反応における量の偏差は、ターゲットの定量におけるばらつきの増加と精度の低下につながる可能性があります。
3. アッセイ性能の一貫性：臨床研究目的でdPCRを使用する場合、一貫したアッセイ性能が重要です。各反応で量が等しいと、アッセイの再現性と堅牢性が向上し、経時的および異なる装置間での結果の信頼性が向上します。

dPCR装置がポジティブマイクロ反応とネガティブマイクロ反応を明確に識別するという要件は、正確なターゲット定量と信頼性の高いデータ解釈のために非常に重要です（dMIQE Group、2020）。ポジティブマイクロ反応とネガティブマイクロ反応の明確な区別は、次のようないくつかの理由で不可欠です：

1. 正確なターゲット検出：dPCRの主な目的は、サンプル中のターゲット分子の存在を正確に検出および定量することです。（ターゲットを含有する）ポジティブマイクロ反応と（ターゲットを含有しない）ネガティブマイクロ反応間の明確な識別は、正確な数のターゲット分子が同定および測定されるために重要です。
2. 偽のポジティブおよびネガティブの回避：明確な識別は、偽ポジティブ(マイクロ反応を誤ってポジティブと識別する)と偽ネガティブ(ポジティブのマイクロ反応を検出できない)のリスクを最小限に抑えるのに役立ちます。誤った結果は、不正確な結論や実験データの誤った解釈につながる可能性があります。
3. 散布図の「ばらつき」の量を減らす：中程度の蛍光レベルのマイクロチャンバーは、「ばらつき」と見なされるものを生じさせます。 dPCR装置は、最適でない増幅効率の可能性を避けるために、ポジティブとネガティブのマイクロチャンバーの境界を正確に定義するための、信頼性が高く、調整可能なしきい値設定機能を有している必要があります。
4. トランスレーショナル研究アプリケーションの向上：臨床研究およびトランスレーショナル研究では、迅速に疾患関連マーカーを特定したりモニタリングする目的で、正確なターゲット検出が重要です。明確な識別により、ターゲット分子の高感度かつ特異的な検出が可能になり、dPCRのトランスレーショナル研究の能力が向上します。

The dMIQE Group.(2020).The digital MIQE guidelines update: Minimum information for publication of quantitative digital PCR experiments for 2020.Clinical Chemistry, 66(8), 1012-1029. https://academic.oup.com/clinchem/article/66/8/1012/5880117