リアルタイム PCR の基礎

リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）では、PCR の進行をリアルタイムでモニターすることができます。そのため、PCR 終了後ではなく、全 PCR プロセスを通してデータを収集できます。これにより、PCR ベースの DNA および RNA の定量アプローチに革命がもたらされました。リアルタイム PCR（qPCR）では、最終 PCR サイクル後に蓄積しているターゲットの量を解析するのではなく、各サイクル毎にターゲットの増幅が解析されます。核酸ターゲットの開始コピー数が多いほど、蛍光の大幅な上昇が早く観察されます。一方、エンドポイントアッセイ（「プレートリードアッセイ」とも呼ばれます）では、最終 PCR サイクルの後に蓄積している PCR 産物が測定されます。

概要

弊社では、配列検出システム（SDS）機器を用いて PCR 産物を検出するためのケミストリーを2種類開発しました：

• Applied Biosystems™ TaqMan® ケミストリー（「蛍光 5´ クレアーゼケミストリー」としても知られています）
• Applied Biosystems™ SYBR™ Green I 色素ケミストリー

TaqMan ケミストリー

TaqMan ケミストリーは、蛍光プローブを使用して、PCR サイクル中に蓄積する特異的な PCR 産物を検出することを可能とします。

TaqMan ケミストリー が使用されるアッセイタイプ

TaqMan ケミストリーは、以下のアッセイタイプに使用できます：
下記の定量が含まれます：

• 1ステップ RT-PCR による RNA 定量
• 2ステップ RT-PCR による RNA 定量
• DNA／cDNA 定量
  • アレル識別
  • IPC を用いたプラス／マイナス判定

 SYBR Green I 色素ケミストリー

SYBR Green I 色素ケミストリーには、二本鎖 DNA に高特異的に結合する色素である Applied Biosystems™ SYBR™ Green I が使用され、PCR サイクル中に蓄積される PCR 産物を検出します。SYBR Green I 色素ケミストリーが非特異的な反応産物を含むすべての二本鎖 DNA を検出することは、TaqMan と SYBR Green I 色素ケミストリーの重要な違いです。そのため、正確な結果を得るためには、反応が十分に最適化されていることが必要とされます。

SYBR Green I 色素ケミストリーに使用されるアッセイタイプ

SYBR Green I 色素ケミストリーは、以下のアッセイタイプに使用できます：

• 1ステップ RT-PCR による RNA 定量
• 2ステップ RT-PCR による RNA 定量
• DNA／cDNA 定量

TaqMan ケミストリー

バックグラウンド

当初、リアルタイム PCR（qPCR）産物を測定する際には、インターカレーター色素が用いられていました。この色素による検出の大きな弱点は、蓄積される PCR 産物は特異的なものも非特異的なものも、両方検出してしまうことでした。

TaqMan ケミストリーの開発

PCR のリアルタイムシステムは、Taq DNA ポリメラーゼの 5′ ヌクレアーゼ活性を使用した蛍光標識プローブの導入により改善されました。これらの蛍光プローブが利用できるようになり、特異的な増幅産物のみを検出するためのリアルタイム法の開発が可能になりました。蛍光標識プローブの開発は、プローブの分解を検出することにより PCR 後の処理を排除することも可能としました。

TaqMan 配列検出ケミストリーの仕組み

TaqMan ケミストリーは、蛍光プローブを使用して、PCR 中に蓄積する特異的な PCR 産物を検出することを可能とします。仕組みは以下の通りです：

プロセスのステップ

1. オリゴヌクレオチドプローブは、5′ 末端にはレポーター蛍光色素が、および3' 末端にはクエンチャー色素がそれぞれ結合した構造になっています。プローブ分解前は2つの蛍光が近接しているため、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）によって、レポーター色素が発光する蛍光はクエンチャー色素によって大幅に減少します。
2. ターゲット配列が存在する場合、プローブは片側のプライマー部位の下流にアニールします。その後このプライマーからの伸長反応に伴い、Taq DNA ポリメラーゼの 5 'ヌクレアーゼ活性によってプローブは切断されます。
3. プローブの切断により：
   • レポーター色素はクエンチャー色素から遊離するため、レポーター色素シグナルが増加します。
   • ターゲット鎖からプローブが離れた後も、鋳型鎖の末端までプライマーからの伸長反応は進みます。従って、プローブが存在しても全体的な PCR プロセスは阻害されません。
4. サイクル毎に切断されたプローブからのレポーター蛍光分子が増えていくので、アンプリコンの増幅量に比例して蛍光強度は増加します。

2 種類の TaqMan プローブ

Applied Biosystems™ TaqMan® プローブは 2 種類あります：

• Invitrogen™ TAMRA™ 色素をクエンチャー色素として含む TaqMan プローブ
• Applied Biosystems™ TaqMan® MGB プローブ

対立遺伝子識別アッセイに推奨される TaqMan MGB プローブ

特に、従来の TaqMan プローブが 30 塩基を超える場合は、対立遺伝子識別アッセイに TaqMan MGB プローブを使用することをお勧めします。TaqMan MGB プローブは以下から構成されます：

• 3' 末端の非蛍光クエンチャー ― クエンチャーは蛍光を発しないため、SDS（配列検出システム）機器はレポーター色素の蓄積量をより正確に測定することができます。
• 3' 末端の MGB（マイナーグルーブバインダー ― MGB はプローブの融解温度（Tm）を上昇させ、より短いプローブの設計を可能にします。

その結果、TaqMan MGB プローブは、適合プローブと非適合プローブの間で大きく異なる Tm 値を示し、より正確な対立遺伝子識別ができます。

TaqMan ケミストリーの利点

TaqMan ケミストリーには、以下の利点があります：

• 蛍光シグナルの生成に、プローブとターゲット間の特異的ハイブリダイゼーションが必要
• プローブは異なる識別可能なレポーター色素で標識可能で、1つの反応チューブ中で 2 つの異なる配列の増幅および検出が可能
• PCR 後の処理が不要となり、アッセイの操作や材料コストを削減

TaqMan ケミストリーの欠点

主な欠点は、異なる配列には異なるプローブの合成が必要なことです。

バックグラウンド

二本鎖 DNA に結合する小分子は、2 つに分類できます：

• インターカレーター
• MGB（マイナーグルーブバインダー）

結合方法にかかわらず、リアルタイム PCR の検出用の DNA 結合色素には 2 つの条件があります：

• 二本鎖 DNA への結合時に蛍光を増加させる
• PCR を阻害しない

弊社では、PCR の阻害がほどんどなく、エチジウムブロマイドに比べて検出感度が高い SYBR Green I 色素をPCRに使用できるよう開発しました。

SYBR Green I 色素ケミストリーの仕組み

SYBR Green I 色素ケミストリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）中に形成される二本鎖 DNA に結合することにより、PCR 産物を検出します。反応の仕組みは以下の通りです：

ステップバイステップ プロセス

SYBR Green I 色素は、サンプル中に存在する二本鎖 DNA と結合することで蛍光を発します。

1. PCR 中、Applied Biosystems™ AmpliTaq Gold™ DNA Polymerase はターゲット配列を増幅し、PCR 産物、すなわち「アンプリコン」を生成します。
2. その後、SYBR Green I 色素は、二本鎖 DNA の新しい各コピーに結合します。
3. PCR が進行するにつれ、より多くの PCR 産物が生成されます。SYBR Green 色素はすべての二本鎖 DNA に結合するため、その結果、増幅される PCR 産物の量に比例して蛍光強度が増加します。

SYBR Green I 色素の利点

SYBR Green I 色素ケミストリーには、以下の利点があります：

• あらゆる二本鎖 DNA 配列の増幅のモニターに使用可能
• プローブは不要で、アッセイのセットアップおよびランニングコストを削減

SYBR Green I 色素の欠点

主な欠点は、偽陽性シグナルを検出する可能性があることです。なぜなら、SYBR Green I 色素はどの二本鎖 DNA にも結合するため、非特異的な二本鎖 DNA 配列にも結合する可能性があるからです。

さらなる考察

DNA 結合色素の使用における他の考慮のポイントは、複数の色素分子が1つの増幅 DNA 分子に結合するということです。これにより、増幅産物の検出感度が向上します。複数個所に色素が結合するので、反応で増幅した二本鎖 DNA の質量に依存して蛍光シグナル値は変動します。つまり、増幅効率が同じ場合、短い産物よりも長い産物のほうが、より強いシグナルを発します。これは蛍光プローブの使用とは対照的です。蛍光プローブではその長さに関わらず、合成された各増幅分子毎に、1個のリポーター蛍光分子がクエンチングから解放されて発光します。

定量アッセイとは？

定量アッセイとは、リアルタイム PCR（qPCR）アッセイのことです。各サイクル毎に核酸ターゲットの増幅量が測定（定量）されます。ターゲットは、DNA、cDNA、または RNA です。このケミストリーガイドでは、以下の 3 タイプのターゲットの定量アッセイについて説明しています：

• DNA／cDNA 定量
• 1 ステップ逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を用いた RNA 定量
• 2 ステップ RT-PCR を用いた RNA 定量

定量解析で使用される用語

アンプリコン：PCR プロセスによって生成する短い DNA セグメント
増幅プロット：各サンプルの蛍光シグナル増加量をサイクル数に対してプロットしたもの
ベースライン：蛍光シグナルにほとんど変動がない、PCR の初期サイクルにおけるシグナルレベルのこと
Ct（threshold cycle）：反応の蛍光シグナルが Threshold Line（閾値）と一致する PCR サイクル数。
NTC（テンプレートを含まないコントロール）：増幅の質の確認（DNA の初期コピー数の算出）に用いられます。
核酸ターゲット：（「ターゲットテンプレート」とも呼ばれます） ― 増幅させたい目的の DNA または RNA 配列
パッシブリファレンス: インターナルリファレンスとして、データ解析中にレポーター色素シグナルの標準化に使用される色素。標準化は、わずかなウェル間の濃度や量の違いによる PCR に関連しない蛍光変動を補正するのに必要とされます。パッシブリファレンス色素は、すべての SDS PCR 試薬キットに含まれています。
Rn（ノーマライズ済みレポーター) ：レポーター色素の蛍光発光強度をパッシブリファレンス色素の蛍光発光強度で割って標準化された蛍光シグナルの強度。
Rn+: テンプレートを含む全コンポーネントの反応の Rn 値。
Rn-：未反応サンプルの Rn 値。Rn- 値は、下記から得られます：

• リアルタイム PCR（qPCR）ランの初期サイクル（蛍光の増加が検出される前のサイクル）、または
• テンプレートを含まない反応

ΔRn（delta Rn）: 所定のPCR 条件で生じた蛍光シグナルの大きさ
ΔRn 値は、次式で計算します：（Rn+） – （Rn-）
スタンダード：検量線の作成に使用される既知濃度のサンプル。スタンダードの段階希釈物をランすることによって、検量線を作成します。この検量線から未知濃度のサンプルの量を推定することができます。
Threshold（閾値）: 初期 PCR サイクルの Rn の平均標準偏差で、調整可能なファクター。Threshold は、PCR 産物の指数関数的増幅領域内に設定される必要があります。
未知の：テンプレート量が不明のサンプル。これは、定量を行うサンプルです。

リアルタイム PCR（qPCR）定量アッセイの方法

PCR の初期サイクルにおいては、蛍光シグナルにほとんど変動がありません。この領域を増幅プロットのベースラインと定義します。ベースラインより上の蛍光の増加が、蓄積しているターゲットの量を示しています。Threshold はベースラインより上に設定可能です。パラメータ CT（threshold cycle）は、増幅したターゲットの蛍光シグナルが特定の閾値に達するサイクル数として定義されています。

概要

定量アッセイの結果を算出する場合、絶対定量または相対定量のいずれかを選択可能です。

絶対定量とは？

絶対定量アッセイでは、検量線に当てはめることにより未知サンプルを定量します。

例

絶対定量は、疾患状態の指標となるウイルスのコピー数定量に使用可能と考えられます。疾患進行をモニターするために、所定の生物学的サンプルにおけるターゲット RNA の正確なコピー数を求めることは研究者の関心を集めています。絶対定量は、すべての SDS 機器で実施可能で、データを得ることができます。そのためには先立ってスタンダードの絶対定量を実施しておく必要があります。

相対定量とは？

相対定量は、リファレンスサンプル（未処理コントロールサンプルなど）の検量線と比較することで所定のサンプルにおける遺伝子発現量の変化を解析する手法です。

例

相対定量は、化学物質（薬物）に対する遺伝子発現の測定にも使用可能と考えられます。この場合、化学処理したサンプルにおける特定の目的遺伝子の遺伝子発現レベルを未処理サンプルにおける遺伝子発現レベルと比較します。

相対定量のための計算方法

相対定量は、すべての SDS 機器で実施可能で、データを得ることができます。相対定量に用いられる計算方法には以下があります：

• 検量線法
• 比較 CT 法

定量法の選択すべての方法で同等の結果が得られます。選択する際は以下に留意してください：

• ターゲットおよび内在性コントロールの増幅を個別のチューブで実施し、解析に検量線法を用いる場合、最適化と検証に必要とされるサンプルは最小量です。
• 比較 CT 法を使用する場合、ターゲットと内在性コントロールの増幅効率がほぼ等しいことを確認するための検証実験を行う必要があります。比較 CT 法を使用する利点は、検量線が不要であることです。これにより、検量線サンプル用のウェルの使用が不要となり、スループットが向上します。加えて、検量線サンプルの調製における希釈エラーも排除されます。
• 同一チューブでターゲットおよび内在性コントロールを増幅する場合、プライマー濃度の制限について確認され、CT 値に影響しないことが示されている必要があります。同一チューブでターゲットおよび内在性コントロールを増幅できるため、スループットが向上し、ピペット操作エラーが低減します

用語

以下は、ここでの絶対定量および相対定量の説明に使用されている用語です：

スタンダード：検量線の作成に使用される既知濃度のサンプル。
リファレンス：実験データの標準化に使用されるパッシブまたはアクティブなシグナル。内在性コントロールおよび外来性コントロールは、アクティブリファレンスの例です。アクティブリファレンスとは、PCR 増幅の結果生じるシグナルを意味します。アクティブリファレンスは、それ自身のプライマー・プローブセットも一緒に使用します。
内在性コントロール各実験サンプルで同様のレベルで発現している RNA または DNA のことです。内在性コントロールをアクティブリファレンスとして使用することにより、メッセンジャー RNA（mRNA）ターゲットの定量を各反応に添加された総 RNA 量の差に応じて標準化することが可能です。
外来性コントロール実験サンプルに含まれない配列を有する RNA または DNA で、既知濃度で各サンブルに添加して使用します。外来性アクティブリファレンスは、通常、内在性ポジティブコントロール（IPC）として使用可能な in vitro コンストラクトで、真の陰性結果と PCR 阻害の影響を受けた偽陰性結果の識別を可能とします。外来性リファレンスは、サンプル抽出効率や逆転写による相補的 DNA（cDNA）合成の差を標準化するのにも使用できます。アクティブリファレンスを使用してもしなくても、ROX 色素が含まれたパッシブリファレンス を使用することは、蛍光シグナルを標準化しPCR に起因しない蛍光の変動を補正するのに重要です。
標準化されたターゲット量：種々のサンプル中のターゲットの相対量を比較するのに使用できる無名数。
キャリブレータ：相対定量結果を得るための基準として使用されるサンプル。

概要

相対定量のための検量線を用意することは簡単です。なぜなら、相対発現量はキャリブレータなどの基準となるサンプルにおける発現量に対する相対値として表されるからです。すべての実験サンプルについて、ターゲットの量は検量線から決定されます。その後、ターゲット値をキャリブレータにおけるターゲットの量で割ることにより、標準化されたターゲット値が得られます。　 つまり、キャリブレータサンプルの発現量は 1 倍となり、それ以外のすべてのサンプルの発現量はキャリブレータの n 倍として表されます。例えば、遺伝子発現に及ぼす薬剤の作用を調べる場合には、未処理のコントロールが適切なキャリブレータとなります。

重要なガイドライン

以下のガイドラインは、相対定量のための検量線法を適切に使用するために極めて重要です：

• ストックの RNA または DNA が正確に希釈されていることが重要ですが、この希釈を表す単位は無関係です。コントロール細胞株から調製したトータル RNA の2 倍希釈系列を検量線の作成に使用する場合は、単位は 1、0.5、0.25、0.125 などの希釈値になります。同じストックの RNA または DNA を複数のプレートの検量線の作成に使用することによって相対定量結果をプレート間で比較することが可能です。
• DNA の検量線を RNA の相対定量に使用することは可能です。この場合、全サンプルでターゲットの逆転写効率が同じであることが前提となりますが、この効率の正確な値が既知である必要はありません。
• 内在性コントロールに対して標準化する定量では、ターゲットと内在性リファレンスの両方の検量線を用意します。各実験サンプルについて、ターゲットおよび内在性コントロールの量が適切な検量線から決定されます。その後、ターゲットの量を内在性リファレンスの量で割ることにより、標準化されたターゲット値が得られます。繰り返しになりますが、実験サンプルの1つはキャリブレータ、または 1× サンプルです。それぞれの標準化されたターゲット値を、ターゲット値で標準化されたキャリブレータで割ることにより、相対発現レベルが得られます。

内在性コントロール

内在性コントロールの増幅は、反応系に添加したサンプル RNA または DNA の量を標準化するために実施されます。遺伝子発現の定量には、ß-アクチン、グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（GAPDH）、リボソーム RNA（rRNA）や他の RNA が内在性コントロールとして使用されています。

スタンダード

サンプルの量は、キャリブレータの量で除算されるため、検量線からの単位はありません。従って、スタンダードに必要とされるのは相対的な希釈倍率が既知であることのみです相対定量において、これは適切なターゲットを含むあらゆるストックの RNA または DNA がスタンダードの調製に使用可能であることを意味します。

比較 CT 法は、数式 2−^ΔΔC_T を用いることを除いて、検量線法に類似しており、相対検量線法と同じ結果が得られます。

数式：

比較 CT 法は、ターゲット（目的遺伝子）の増幅効率とリファレンス（内在性コントロール）の増幅効率がほぼ等しいことを前提にした定量法です。
比較 CT 法（相対定量）に関する詳細は、User Bulletin #2: Relative Quantitation of Gene Expression (PN 4303859) をご覧ください。

概要

検量線法（絶対定量）は、先立ってスタンダードの絶対定量を実施しておく必要があることをを除いて、相対検量線法（相対定量）に類似しています。

重要なガイドライン

以下のガイドラインは、絶対定量のための検量線法を適切に使用するために極めて重要です：

• DNA または RNA は、単一で高純度であることが重要です。例えば、E. coli から調製したプラスミド DNA には RNA が混入していることが多く、その場合、A260 値が上昇し、プラスミドのコピー数が実際よりも高く測定されます。
• ピペッティングの正確さは極めて重要です。ダイナミックレンジが数桁で非常に高感度であるため、不正確さの影響が極めて大きいからです。プラスミド DNA または in vitro 転写 RNA は、正確な A260 値が測定できるように濃縮する必要があります。濃縮した DNA または RNA は、生物学的サンプルにおけるターゲットに類似した濃度にするために 10⁶ ～ 10¹² 倍に希釈します。
• 希釈したスタンダード（特に RNA）の安定性は考慮する必要があります。希釈したスタンダードを小分けして、–80 °C に保存し、使用直前にのみ解凍します。

 通常、DNA を RNA の絶対定量用のスタンダードとして使用することはできません。なぜなら、逆転写ステップの効率の差を評価できないからです。

スタンダード

先立ってスタンダードの絶対定量を実施しておく必要があります。絶対定量スタンダードの調製には、通常、プラスミド DNA および in vitro 転写 RNA が使用されます。濃度は A₂₆₀ 値により測定され、DNA または RNA の分子量を用いてコピー数に変換されます。

The PCR process and 5’ nuclease process are covered by patents owned by Roche Molecular Systems, Inc. and F. Hoffmann-La Roche Ltd. 

All other trademarks are properties of their respective owners.