酵素プローブ

酵素は、一次/二次抗体、ビオチン、アビジン、または標的タンパク質に結合するタンパク質など、タンパク質へ融合することによって標的タンパク質を検出する用途に使用されます。それから、酵素と反応する特異的基質を添加すると、有色沈殿物または光や蛍光を放出する、可視性の反応生成物が形成されます。その後、顕微鏡法やスキャン法により、シグナルを検出します。

標的タンパク質の検出において酵素プローブ（別名：レポーター）を使用すると、以下3つの利点が加わります：

• 高感度–シグナル出力を容易に検出できるため、低濃度の標的タンパク質を同定できます。さらに、このシグナル増幅法では、標的タンパク質の部位において酵素分子数を飛躍的に増加させることができます。結果として、酵素レポーターは迅速なターンオーバーを示すことによって、所定の時間単位中に酵素ひとつあたりに転換される基質の量が増加します。
• 貯蔵寿命が長い–酵素は、適切に保存すれば非常に長期間安定保存できます。また、基質は光に不安定ですが、酵素自体は光に安定です。
• 多彩なアウトプット – 発色、化学発光または蛍光いずれかを提示する基質は一般的な酵素プローブに使用できます。

上記3つの利点によって、酵素プローブの多用途性と利便性が示されますが、適切なタイプの検出プローブを選択する際には、以下の使用制限を考慮しなければなりません：

• サイズが大きい –酵素レポーターは、有機蛍光化合物 (例：FITC、TRITC、AMCA)よりも極めて大型であるため、酵素の結合したタンパク質の生物学的機能が妨害される可能性があります。
• 基質の必要性 –タンパク質を検出するためには、酵素プローブに基質を添加する必要があります。また使用する基質に応じて、この反応は環境条件（例：光、温度）や周囲の光の影響を受ける可能性があります。
• 内因性干渉 –サンプル中の標的タンパク質の検出に用いる酵素は、使用した実験系（例：組織、細胞）において発現していることがあります。内在性酵素によって、阻害をかけない限り基質からバックグラウンドシグナルが生成され得ます。

酵素は基質と反応して、発色性、蛍光性または化学発光性の測定可能シグナルを生成することにより、アッセイレポーターとして機能します。基質には可溶性または不溶性タイプがあります（本ページ以下をご覧ください）。

酵素プローブは汎用性が高く多種多様な巨大分子へ結合させることができ、また種々の基質を利用できることから、様々な実験用途において広く利用されています。直接的・間接的な抗体検出法を用いたタンパク質検出には、主に酵素が利用されます。直接検出法では、酵素は標的タンパク質に結合する一次抗体に結合させます。また間接検出法では、酵素は一次抗体を標的とする二次抗体に結合させます。またアビジン-ビオチンシグナル増幅システムで酵素を利用するために、一般にビオチンまたはアビジンへ酵素を結合させます。

沈殿基質を使用する発色検出法は、免疫組織化学 (IHC)で用いられる主要なタンパク質検出法です。ただし近年では、技術革新や蛍光検出機器の有用性が拡張されたことに伴い、蛍光プローブの利用が増加しています。化学発光基質は高感度で直線的な検出結果が得られることから、ウェスタンブロット解析によるタンパク質検出に一般的に使用されています。このアプリケーションには、発色沈殿基質、また近年では蛍光基質も利用されています。ELISA 用の基質として、一般に化学発光性、蛍光性および可溶性発色性の基質が使用されます。各タイプの基質は、種々の実験法において特異的な特性を示します。

西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP)によって、基質から過酸化水素への二つの電子の移動が触媒され、基質の酸化物および水が生成されます。タンパク質の検出において、HRP基質（以下の表に記載）は酸化時に発色、化学発光または蛍光シグナルを生成する特性があります。分子量40,000のHRPは、他の酵素タンパク質より小型です。サイズが小さいため、サンプルの組織や細胞への浸透性に優れ、結合タンパク質の機能を妨害する可能性が低いです。またHRPは、結合に利用可能な4つのリジンを有しており、目的タンパク質への架橋効率が向上します。

HRPは代謝回転速度が高く、生理的pH（7.6）で反応生成物を短時間に多量に産出します。HRP-IgG融合体は、高特異性の酵素活性（抗体のHRP/モルが高い）や免疫学的反応（HRPはサイズが小さいため立体障害が少ない）のため、アルカリホスファターゼとβ-ガラクトシダーゼの複合体より優れています。

HRPの使用に関する主要な問題として、特定の組織における内因性ペルオキシダーゼ活性に起因して、非特異的な染色が起こることです。通常クリオスタット切片には大量の内因性ペルオキシダーゼ活性が含まれますが、市販のペルオキシダーゼ阻害剤を利用すれば、内因性ペルオキシダーゼ活性を低減または除去できます。HRPは、パラフィン包埋切片の染色の用途で一般的な酵素標識であり、内因性活性を阻害することができます。

HRPの第二の欠点として、微生物に対して、また微生物に対抗するために用いる抗菌剤による分解に対して過敏である点が挙げられます。アジ化ナトリウムはHRPの強力な阻害剤ですが、酵素は0.01%のチメロサール中に貯蔵できます。HRP活性は、シアン化物、硫化物および酸化物にも阻害されます。HRPの3つ目の欠点として、一部の西洋ワサビペルオキシダーゼ基質の反応生成物に関する変異原性および発癌性が挙げられます。上記の問題点がひとつでも懸念される場合、他の酵素マーカーを使用することが推奨されます。

アルカリホスファターゼ(AP)は、広範に分布する酵素ファミリーであり、ヌクレオチドやタンパク質のリン酸エステルを加水分解します。酵素の至適pHは9.0～9.6です；これらの酵素は二価陽イオンによって活性化されます。またシステイン、シアン化物、ヒ酸、無機リン酸塩、およびEDTAなどの二価カチオンキレート剤により阻害されます。

哺乳動物には2形態のアルカリホスファターゼがあります；それらは、種々の組織中に分布する形態と、腸内のみに見られる形態に分類できます。それぞれは、阻害剤に対する感受性、や熱安定性が異なります。基質バッファーに1 mMのレバミゾールを添加すると、組織のアルカリホスファターゼ活性が阻害されます。切片を処理することにより腸アルカリホスファターゼ活性を阻害しておき、その後20%の酢酸を用いて4℃で15秒間の染色 （または2.3%の過ヨウ素酸を用いて、5分間の染色）を行い、さらに0.02%の水素化ホウ素カリウムを用いて、2分間の染色を行います。

ペルオキシダーゼ阻害剤が無効なクリオスタット切片などを用いた、高レベルの内因性ペルオキシダーゼによりHRP複合体の使用が禁忌となるアプリケーションには、ウシ腸アルカリホスファターゼ複合体を使用するのが最適です。

ウシ腸アルカリホスファターゼ（分子量14万）は、標識として使用する場合、他の酵素よりいくつか利点があります。反応速度が線形を維持するため、長期間反応を進行させることによって感度が向上します。ウシ腸アルカリホスファターゼは、アジ化ナトリウムまたはチメロサールなどの抗菌剤へ曝露しても、活性が阻害されないため、非滅菌環境下で長期間保存できます。組織型アルカリホスファターゼの内因性活性は1 mMのレバミゾールによって阻害されるため、この酵素で標識された抗体は多種多様な組織用マーカーとして使用できます。

グルコースオキシダーゼは、β-D-グルコースの酸化を触媒して過酸化水素とグルコン酸を生成するアスペルギルス・ニガーから単離された酵素です。グルコースオキシダーゼは、分子量16万の二量体糖タンパク質です。グルコースオキシダーゼの阻害剤には、Ag⁺, Hg²⁺, Cu²⁺, p-クロロ第二水銀安息香酸および酢酸フェニル水銀が含まれています。

哺乳動物組織は内因性グルコースオキシダーゼ活性を持たないため、一般にグルコースオキシダーゼは、ペルオキシダーゼやホスファターゼの高い内因性活性を有するサンプルの標識に用いられます。ただし、コアグラーゼにより過酸化水素の反応最終生成物が破壊されるため、低カタラーゼ活性のグルコースオキシダーゼを選択することが重要です。

β-ガラクトシダーゼは、様々なガラクトピラノシド誘導体を加水分解できるE. coliから単離された酵素であり、水溶性および水不溶性の両タイプの生成物を産出します。NaClは活性化因子であり、Mg²⁺はこの酵素の補因子です。β-ガラクトシダーゼの最適pH範囲は7.0～7.5です。免疫組織化学染色において、パラフィンでサンプルを包埋することによって内因性酵素による潜在的な干渉を克服できます。

β-ガラクトシダーゼは高感度であり、哺乳動物細胞において内因性活性を一切示さないため、内因性酵素活性が持続的な問題となるアプリケーションにおいて有用です。β-ガラクトシダーゼは、様々な架橋剤によってIgG抗体断片、免疫グロブリン全体およびインスリンへの結合が可能です。β-ガラクトシダーゼの基質タイプが限られている点が、唯一の欠点と言えます。

発色基質は長年にわたり広範に使用されており、極めてシンプルかつ費用対効果の高い検出法が実現します。発色基質は、酵素-基質反応による各生成物の性質に基づいて2種類に分類されます。沈殿基質が適切な酵素に接触すると、不溶性生成物に変換されて、サンプルまたは膜上に沈殿します。これらの生成物の性質は不溶性であるため、一般に沈殿基質はIHCやウェスタンブロッティングに使用されます。対照的に可溶性基質 は、試験溶液中に溶解する水溶性・着色性の生成物を産出します。これは通例ELISAで使用されます。この2種類の発色基質は、生成物の性質だけでなく、使用する検出装置もそれぞれ異なります。沈殿基質は、光学顕微鏡のような特殊装置を用いずに、不溶性生成物の存在・強度・局在を検出できます。マイクロプレートリーダーを用いて吸光度を測定することにより、溶液中の可溶性生成物の含量が明らかになります。様々な仕様と形態の発色性ブロッティング基質を取り揃えています。酵素標識、必要な感度、およびシグナル形態や検出法に基づいて、適切な基質を選択してください。

両タイプの発色基質とも、タンパク質検出はフィルムの現像に似ています；サンプルは、十分に発色するまで基質中でインキュベートされた後、反応の停止や生成物含量の測定を行います。この手法ではデータ解像度の制御ができます。しかし発色基質は低感度であるため、低存在量タンパク質の検出への最適化が困難です；反応は数時間から一晩中まで可能ですが、同時にバックグラウンドシグナルも発生してしまいます。感度の劣る発色基質は、タンパク質存在量の高いアプリケーションに最適です。基質を適正に貯蔵すれば基質反応による生成物は安定化できるため、シグナルが安定します。したがって一般に発色基質は、ウェスタンブロットにおける化学発光基質で発生し得る偽陰性結果（例：ゴーストバンド）に関わる問題が発生しません。

一般に発色基質は高存在量タンパク質の検出に利用され、反応経過を視覚的に追跡できます；このため、化学発光や蛍光のブロッティングシステムよりも柔軟性の高い最適化を行えます。ただし、別の販売元による特定基質については、大幅に性能が異なる場合があります。これは、基質の濃度や純度によって、また製剤の一部である添加剤やバッファーの成分によって、各性能が影響され得ることに起因します。

化学発光基質は、他の検出法には無い利点がいくつかあるため需要が高いです。利点の一例として、線形応答範囲が広いため、広範なタンパク質濃度の検出や定量化できます。ルミノールは主要な化学発光試薬のひとつです；ルミノールを過酸化物で酸化させると、励起状態の3-アミノフタレートが形成されます。これは425 nmの波長で光子を放出することによって低エネルギー状態へと減衰します。

検出光は反応による一過性生成物であり、酵素基質反応の発生中にのみ発光するという点で、化学発光基質は他の基質と異なります。これは、安定した着色性生成物を産出する発色基質とは対照的です。化学発光反応において、基質は反応における律速試薬です；基質が消耗するにつれて、発光は減衰して最終的には消失します。適切な酵素複合体溶液を用いて十分に最適化された手順を取れば、数時間にわたり安定した光出力が生成され、一貫性と感度の高いタンパク質検出を実現します。

一般に化学発光基質は、X線フィルム、ホスフォイメージャーまたはCCDカメラを用いたウェスタンブロット解析による、短時間の迅速なタンパク質検出に利用されています。

一般に標的タンパク質の検出には蛍光タグ付きの抗体や分子が使用されますが、蛍光基質を用いて酵素を検出することも可能です。蛍光基質は、酵素プローブにより代謝されるまでは非蛍光性または低蛍光性のままですが、代謝後には強烈な蛍光を発します。蛍光顕微鏡イメージング、蛍光マイクロプレートリーダー、および解析ソフトウェアなどを用いると、蛍光基質は感度が向上し、迅速な定量を行えます。

HRPやAPなどの酵素を用いて抗体やタンパク質結合体を調製するために、いくつか手法が開発されており、一般的に利用されています。あらゆるタイプの酵素標識二次抗体が市販されていますが、特殊な一次抗体やタンパク質プローブについては、研究者自身で標識を行う必要があるでしょう。

グルタルアルデヒドは、タンパク質結合に用いられる架橋試薬の中でも極めて単純なものです。これはアミン基と反応し、架橋します。還元条件下において、グルタルアルデヒドの両端のアルデヒドはアミンと結合して、第二級アミンを形成します。本試薬はタンパク質結合に極めて効果的ですが、様々な高分子量ポリマーが形成される傾向があり、結果の再現性が困難です。

HRPや糖タンパク質の結合を優れた方法で行うには、還元的アミノ化の後にヨウ素酸活性化を行います。過ヨウ素酸でグリコシル化酵素を処理すると、糖のシス-ジオール基の酸化（とりわけ、糖タンパク質・多糖類において一般的なシアル酸）が起き、アルデヒド基が形成されます。その後、このアルデヒド基は、（穏やかな還元シアノ水素化ホウ素の存在下で）添加した抗体や分子の第一級アミンと効果的に反応します。その結果、アミド結合による安定した結合が形成されます。

最後にスルホSMCCまたはヘテロバイファンクショナル架橋剤を用いて、1段階または2段階で、抗体やタンパク質と酵素分子を架橋することができます。1段階目で酵素を活性化および精製することができ、2段階目で標的タンパク質へ酵素を結合させます。したがって2段階手法を取ることによって、より高精度に架橋反応を制御できます。これによって架橋は一定方向に行われ、過重合を起こす可能性が低減します（例：酵素上のアミンは、抗体上のスルフヒドリル基へ配向されます）。

1. Sambrook J. and Russell D. W. (2001) Molecular cloning : A laboratory manual.Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.