Luciferase Reporters

ほぼ100年間にわたり、生物学的アッセイにおける実験的変化を検出する用途に発光が利用されてきました(1)。また、検出に発光を利用したアプリケーションは多様に存在するうえ、発光タイプも多岐にわたります。ルミネセンスとは、化学反応の結果として放出される光であり、熱発生や熱変化が一切起きません。この類の発光は、使用中の白熱電球が熱発生により高温になる白熱発光とは明らかに異なります。ルミネセンスは、以下2種類に分類できます：

• バイオルミネセンス – 生物学的供給源から放出される光
• ケミルミネセンス –化学反応により非生物学的供給源から放出される光

生物学的研究において汎用されている発光の異なるタイプとして蛍光があります。 光源からのエネルギーを吸収し、それを異なる波長の光として放出する分子であるフルオロフォアの産物です。一方バイオルミネセンスは、光源ではなく酵素反応により励起エネルギーが供給されるという点で蛍光とは異なります。バイオルミネセンスおよび蛍光は、広範な研究用途に利用されています。ただしバイオルミネセンスレポーターは、検出能力の感度が非常に高いうえ、バイオルミネセンスレポーターが酵素的性質を有するため蛍光レポーターよりも広いダイナミックレンジを備えています。

蛍光レポーターは、光褪色しやすく量子収量が低いうえ、細胞ベースアッセイではバイオルミネセンスレポーターよりタンパク質の安定性が高いため、リアルタイムレポーターとしての使用には適していません。また細胞成分が自家蛍光の特性を有するため、非特異的バックグラウンドが上昇し、セルベースド-アッセイで蛍光検出の感度が低下します。他方で、細胞成分には固有のバイオルミネセンスが一切無いため、バイオルミネセンスアッセイでの感度が向上します。

とはいえフルオロフォアは活性のためのコファクターや外因性の基質を必要とせず、バイオルミネセンスレポーターよりも安定性が高いため、蛍光レポーターは、バイオルミネセンスタンパク質よりも細胞内標的の可視化において有用性が高いです。

バイオルミネセンスは、自然界において極めて多様で、細菌や渦鞭毛藻類といった単細胞生物および魚や昆虫といった高次生物に見られます。バイオルミネセンスは、陸生生物と水生生物のどちらにも使われていますが、とりわけ深海に生息する海洋動物に多く見られます。バイオルミネセンスは、深海生物にとって自然の様々な目的を果たします。

防衛：被食者は、強烈なバイオルミネセンスシグナルを発することによって、捕食者を一時的に盲目状態に陥らせます。この隙に被食者は危険から脱出できます。被食者の発光によって、さらにこの捕食者が他の捕食者に発見されるリスクが高まります。

カモフラージュ： ホタルイカ、オキアミ、ホシザメ、ハチェットフィッシュ、ハダカイワシといった、通常は深海暗部に生息する生物は摂食のため夜間に海面へ現れます。これらの生物は、月明かりに照らされた周辺環境に溶け込むためにカウンター照明を発します。一部の浅海イカにも同様に、光を放ち月明かりへ溶け込むカモフラージュが見られます。

給餌：獲物を引き付ける目的で、捕食者はバイオルミネセンスを行います。例えばアンコウは捕食する際に、バイオルミネセンスバクテリアを宿す発光器官を支える細長い背鰭棘を利用しています。また、ジュウモンジダコなどのタコ類は、獲物を引き付けるため青緑色に発光する器官で裏打ちされた吸盤を有しています。

交配：ホタルやグローワームなどの陸生生物や八腕類のナツメダコなどの海洋生物は、バイオルミネセンスを利用して交尾相手を誘引します。

バイオルミネセンス反応を起こすには、ルシフェラーゼ（ルシフェラーゼ反応の触媒酵素）およびルシフェラーゼ基質という2つの媒介物が必須です。ルシフェラーゼ酵素は多種多様なタイプが発見されていますが、全ての酵素には共通して、以下のような発光反応の一般メカニズムが見られます： O₂の存在下でルシフェラーゼ基質が酸化的脱炭酸反応して、光子の放出（発光）が起こる。

ルシフェラーゼは進化の過程で多数の進化段階を経て、発現パターン、基質特異性、補因子要求性、酵素反応速度などが異なる酵素を生成するに至ったと考えられます。こうした進化的変異の結果、細菌や真菌などの持続発光できる生物類や、様々な持続時間や強度でバイオルミネセンスを発する生物類が誕生しました。例えば渦鞭毛藻類による発光はわずか0.1秒しか持続しませんが、クラゲの発光は数十秒間持続できます。

種々のルシフェラーゼ酵素によってバイオルミネセンスの産出量が異なるため、各発光キネティクスに基づきバイオルミネセンスを分類して各実験計画へ適用させることができます。Flashキネティクスを備えたルシフェラーゼ酵素はシグナル強度が高いため、極めて高感度ですが、発光は急速に減衰します。対照的にGlowキネティクスを備えた酵素は、やや低感度であるものの、発光が最低60分間安定して持続します。

ルシフェラーゼ酵素は天然状態で活性化され、アンフォールディング時や変性時に活性状態を失う特性があります。この特性は、適切なタンパク質折り畳みに影響する要因に関する研究に利用されてきました。また、ガウシア、メトリディア 、ウミホタルなどのルシフェラーゼは天然分泌されることから、分泌経路のメカニズムや制御に関する研究にも利用されてきました。

バイオルミネセンスは高感度であり関連試薬も使いやすいため、ルシフェラーゼは生物学系の研究において極めて好評を得ています。一般的なバイオルミネセンス使用領域の例：

• In vivoイメージング
• 細胞増殖アッセイ
• タンパク質のフォールディング/分泌解析
• レポーター遺伝子アッセイ

In vivoイメージングは比較的新しい非侵襲的な手法であり、マウスやラットなどの生存動物中の分子イベントの追跡が可能なことから、生物医学研究界に急速に普及しています。動物疾患モデルにおいて、細胞、病原体、タンパク質、分子類などについて、基質を局所的もしくは全身に投与した後、バイオルミネセンスルシフェラーゼで標識して可視化させます。低レベルの光は組織内を通過できます。光の透過性は発光の波長によって異なります。したがって、実験動物の深部から放出されたバイオルミネセンスについては高感度検出系により検出可能ですが、in vivoイメージングのアプリケーションには >600nmの波長で発光するルシフェラーゼが最も高感度となります(2)。

細胞の生存率や増殖を測定するためのバイオルミネセンスアッセイも開発されています。バイオルミネセンス細胞生存率アッセイでは、ATP依存性ルシフェラーゼを用いて代謝活性細胞中に存在する遊離ATPを定量化します。細胞集団の増殖に伴い有効なATP量が増加する結果、細胞集団のバイオルミネセンスシグナルが増強されます。細胞増殖を測定する非バイオルミネセンス法としては以下が一般的です：

• トリチウム化チミジン(³H-チミジン)の測定、あるいはブロモデオキシウリジン(BrdU)の取込みによるDNA合成の定量
• 膜不透過性のDNA挿入色素であるヨウ化プロピジウムを用いた死細胞の同定
• テトラゾリウム塩の還元(MTT)による細胞内環境の還元の定量化
• アラマーブルーの還元と細胞内ATP濃度の定量。

レポーター遺伝子アッセイでは、目的遺伝子の発現を制御する遺伝子調節因子に関する測定を行います。遺伝子は、生成されるタンパク質を特定するコード領域やその転写調節因子などの様々な機能的部分から構成されています。

レポーター遺伝子アッセイの主な目的は、推定される調節因子をレポーター遺伝子へ融合させて、発現されるレポータータンパク質の量を測定することです。レポーター遺伝子は融合した転写因子の制御下にあるため、レポーター発現は調節因子の活性に直接相関します。プロモーター、エンハンサー、または5 '/3'非翻訳領域(UTR)などが調節因子となり得ます。細胞内の転写または翻訳いずれかの現象は、この調節因子によって制御されます。

良質なレポータータンパク質は、アッセイや検出がしやすい特性がありますが、通常これは試験系には存在しません。またレポーター系は、実験系、所要感度、または有効な検出戦略（吸光度/蛍光/バイオルミネセンスの各検出戦略）に基づきます。従来レポーターとして使用されてきたタンパク質には、以下が挙げられます：β-ガラクトシダーゼ(lacZ)；クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)；β-グルクロニダーゼ(GUS) 、蛍光タンパク質 [GFP(緑)、YFP(黄)、RFP(赤)]、分泌型アルカリホスファターゼ(SEAP)。

ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイは、超高感度な検出能力と広範なダイナミックレンジを備えているため、広く一般的に利用されています。これらのアッセイでは、ルシフェラーゼ遺伝子の上流に遺伝子調節因子を配置した後に、得られたレポーター構築物を、遺伝子導入、形質転換または注入によって動物/植物細胞や細菌へ転写します。その後ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現を測定して、標的因子に影響される生物学的経路中の調節因子(cis活性)やタンパク質(トランス活性)の活性度を定量化します。

ルシフェラーゼ酵素をシングルレポーターとして用いて、所定実験で単一の生物学的現象について研究が行えます。ただ、スペクトル特性や基質がそれぞれ異なるため、複数のルシフェラーゼ酵素を併用した多重ルシフェラーゼ実験も実行可能です。このタイプの実験（デュアルスペクトルルシフェラーゼレポーターアッセイ）は、2つのルシフェラーゼの酵素を1つのサンプル中で同時に発現させて検出します。デュアルスペクトルルシフェラーゼレポーターアッセイは、以下の用途に最適です：

• スクリーンごとに複数のターゲットを分析する
• オフターゲット効果を最小限に抑える
• 複数の経路間のクロストークを同定する
• データをノーマライゼーションし、実験における人為的結果を排除する

データノーマライゼーションの実験では、一般に1つのレポーターが実験レポーターとして機能します。そして第2のレポーターは、実験者によるミスあるいは生物学的操作や細胞処置の非特異効果に起因した、非特異的な実験変動の主要因となる内部コントロールとして機能します。実験変動には、以下も含まれます：

• 細胞プレーティングの違い
• 実験処理によって、細胞の生存率や増殖の違い
• 細胞培養インキュベーター中における環境条件の不均一性によるエッジ効果
• レポーター自体の機能に関する処理化合物の非特異的効果

非重複発光スペクトルを有する酵素を用いたデュアルスペクトルルシフェラーゼレポーターアッセイでは、単一試薬を用いた単一サンプル中のフィルタベース検出により同時測定が行えます。こうしたデュアルレポーターアッセイは、同一または異なる基質を用いた形態で販売されています。

重複スペクトルのルシフェラーゼを使用した場合、基質特異性のそれぞれ異なる2種類の試薬を用いて、2ステップでルシフェラーゼの測定が行えます。この2ステップによる手法では、第1のルシフェラーゼによる発光の測定後に酵素を不活性化させます。その後、第2ルシフェラーゼの基質を含む第2試薬を添加して、活性度を測定します。理論上、各酵素の基質特異性がそれぞれ異なっていれば、複数酵素をこのように多重化させられます

デュアルスペクトルルシフェラーゼアッセイは経時変化アッセイに最適であり、分泌型ルシフェラーゼを用いて実験プロモーター活性の測定や、ハウスキーピング遺伝子プロモーターの制御下で細胞内ルシフェラーゼを測定することによって、細胞生存率の測定を行います。以下の動画のようにプロモーター活性によって、ルシフェラーゼは培養培地へ分泌され、実験中の各時点において回収されます。経時変化が完了したら、細胞を溶解させます。そして細胞生存率の対照としての細胞内ルシフェラーゼ活性について、溶解物を測定します。

分泌型ルシフェラーゼレポーターの要求性のため、市販のデュアルスペクトルルシフェラーゼアッセイの中には、経時変化アッセイに適合しないタイプもあります。例えばウミシイタケルシフェラーゼは分泌されないため、Pierce Renilla-Firefly Luciferase Dual Reporter Assay Kitはこのタイプの経時変化アッセイに対応しません。その代わりウミホタルおよびガウシアのルシフェラーゼが分泌されるため、Pierce Cypridina-Firefly and Gaussia-Firefly dual-spectral luciferase kitsが経時変化アッセイに対応します。

1. Keilin D. (1966) The history of cell respiration and cytochrome.Cambridge,: Cambridge U.P. xx, 416.
2. Negrin R. S. and Contag C. H. (2006) In vivo imaging using bioluminescence: A tool for probing graft-versus-host disease.Nat Rev Immunol.6, 484-90.
3. Smith K. C. (1989) The science of photobiology.New York: Plenum Press. viii, 426.
4. Campbell A. K. and Herring P. J. (1990) Imidazolopyrazine bioluminescence in copepods and other marine organisms.Marine Biology.104, 219-25.
5. Robison B. H. and Young R. E. (1981) Bioluminescence in pelagic octopods.Pacific Science.35, 39-44.