Invivofectamine 3.0 Reagent

画期的なin vivo用トランスフェクション試薬

Invivofectamine 3.0 Reagentは、大幅に性能が改良されたin vivo RNAi導入用の画期的な試薬です。マイクログラムレベルのsiRNAを用いて最大85％のノックダウンを達成します。Invivofectamine 3.0 FAQ

研究記事：

Liver Bid suppression for treatment of fibrosis associated with non-alcoholic steatohepatitis

非アルコール性脂肪性肝炎に伴う線維化症治療のための肝Bid抑制

  • Akiko Eguchi1, Xavier De Mollerat Du Jeu2, Casey D. Johnson1, Andronikou Nektaria2, Ariel E. Feldstein1
  • 1Department of Pediatrics, University of California – San Diego, 9500 Gilman Drive, La Jolla, USA; 2Life Technologies Corporation, Carlsbad, USA

シンプルな操作で使いやすい

導入用のInvivofectamine 3.0 ReagentとRNAiの複合体の作製は、試薬の混合、インキュベート（30分）、希釈、注入とシンプルです（図1）。

図1.投与するためのRNAi/Invivofectamine 3.0 Reagent複合体は、わずか数ステップの操作で迅速に調製できます。

高いノックダウン効果

Invivofectamine 3.0 Reagentと、Factor VIIをターゲットするAmbion in vivo siRNAまたはPPIBをターゲットとするStealth RNAiとの複合体は、肝臓組織へのマウス尾静脈注射によって導入されました（図2）。mRNAレベルでFactor VIIおよびPPIBの高いノックダウン効果が確認されました。

図2.Invivofectamine 3.0 Reagentを用いると、一回の静脈投与により肝臓における標的ノックダウンが可能です。Invivofectamine 3.0 Reagentと、Factor VII（FVII）またはPPIBをターゲットとするsiRNAとの複合体を、マウス体重1 kgあたり1 mgの用量（mg/kg）で投与しました。ターゲット遺伝子のmRNAレベルのノックダウン効率は85%でした（TaqMan assayによる測定）。

効果的なノックダウンに使用するsiRNA量を削減

尾静脈注射により、Invivofectamine 3.0 ReagentとsiRNAの複合体を含有量の範囲内で導入しました。投与から24時間後に、発色アッセイを用いて血清中のFVIIタンパク質レベルを測定しました（図3）。ノックダウン効果の高さは、複合体中のsiRNA量と相関しました。Invivofectamine 3.0 ReagentのED50は、0.1 mg/kgです（これまでの導入試薬では、1.0 mg/kgでした）。

図3.Invivofectamine 3.0 ReagentおよびFVIIをターゲットとするsiRNAでは、単回静脈内注射後に肝臓において用量反応ノックダウンが生じました。 Invivofectamine 3.0 ReagentとFVIIをターゲットとするAmbion in vivo siRNAとの複合体を、容量0.02～2 mg/kgの範囲で投与しました。血清を分離し、FVIIタンパク質レベルについてアッセイしました（Biophen® chromogenic assay）。

一回の投与でノックダウン効果が長期間持続

Invivofectamine 3.0 Reagent/siRNA複合体の一回投与により、１日目で有効なノックダウン効果を示し、最大３週間まで持続しました（図4）。より多くのsiRNAを複合体へ投与すると、検証を行った範囲では、より長くノックダウン効果が持続しました。

図4.3種類の濃度のFactor VII (FVII)に対するsiRNAを用いた用量効果の考察。siRNA分子は、Invivofectamine 3.0 Reagentと複合体を形成し、1、0.5、0.25 mg/kgの用量で投与しました。投与から2、5、9、16、23、30日目にそれぞれ血清を採取し、発色アッセイを用いてFVIIタンパク質のノックダウン効率を解析しました。

in vivoにおける遺伝子ノックダウンと相関するフェノタイプ変化が得られる

アポリポタンパク質B（ApoB）は、コレステロールを組織へと運搬するLDL（low-density lipoprotein）に含まれる主要なアポリポタンパク質です。これに相応するように、ApoBの発現抑制の実験において、関連するタンパク質であるコレステロールとトリグリセリドレベルの低下が観察されました。その高いノックダウン効果により、Invivofectamine 3.0 ReagentとApoBを標的とするsiRNAとの複合体は、コレステロールとトリグリセリドの両方を特異的に低下させることができました（図5）。Invivofectamine 3.0 Reagentにより得られる特異性と高い抑制効果により、研究者は観察されたフェノタイプはターゲット特異的なノックダウンに関連するものであり、毒性によるものではないという確信を持つことができるでしょう。

図5.Invivofectamine 3.0 ReagentおよびApoBを標的とするsiRNAを用いた1回の静脈投与による肝臓でのノックダウン。Invivofectamine 3.0 ReagentとApoBsiRNAの複合体を、1.5、0.5、0.25 mg/kgの用量で投与しました。1.5 mg/kgの用量のsiRNAを含む複合体の導入において、mRNAレベルでは>80%のノックダウン、タンパク質レベルでは最大70%までのノックダウン効果が得られました。血清を分離し、コレステロールおよびLDL含有量を解析した結果、ApoBタンパク質のノックダウンにより、コレステロールおよびLDLが著しく減少ししていることが確認されました。

融解後のInvivofectamine 3.0 Reagentの安定性

Invivofectamine 3.0 Reagentの長期保存時の推奨温度は–20℃ですが、Invivofectamine 3.0 Reagentは融解後4℃で少なくとも14日間保存可能であることが確認されています（図6）。試薬を再凍結することなく、実験を数日間継続させることができます。また、必要に応じて、試薬は4回まで性能を損なうことなく、凍結融解することができます（データ無し）。

図6. –20℃で保存されたInvivofectamine 3.0 Reagentは、融解後4℃で最大14日間保管できます。Invivofectamine 3.0 Reagentを融解し、FVIIsiRNAと複合体を形成し、0.125および0.5 mg/kgの用量で静脈投与しました。同一の解凍試薬を使用して、初回投与から引き続き6日目および14日目に行う投与用に複合体を作製しました。各siRNAの投与後、血液を採取し、FVIIタンパク質レベルを評価しました（Biophen® chromogenic assay）。4℃で保存されたInvivofectamine 3.0 Reagentは解凍後に、性能を損なうことなく、最大14日間使用可能であることが確認されました。

in vivo毒性が低い

Invivofectamine3.0試薬のin vivo毒性を評価するために、試薬投与後複数回の時点での血液化学分析およびサイトカイン測定を行いました（図7および8）。Invivofectamine 3.0 Reagentを用いてトランスフェクトした個体のバイオマーカーの値は、トランスフェクション未処理の場合と比較して大きな差異は認められませんでした。

Blood chemistry analysis of samples from mice injected with Invivofectamine 3.0 Reagent

図7.Invivofectamine 3.0 Reagentを投与したマウスから採取したサンプルの血液化学分析。FVIIをターゲットとするAmbion in vivo siRNAとInvivofectamine 3.0 Reagentとの複合体を1 mg/kg [1]、3 mg/kg [3]の用量で投与したマウス、および未処理[U]のマウスを検証対象としました。血液サンプルを2、24、48時間後に採取し、臨床化学アッセイを用いていくつかのバイオマーカー（Antech）について評価しました：グルコース（GLU；mg/dL）、アルカリホスファターゼ（ALP；U/L）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT；U/L）、（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼAST；U/L）、総ビリルビン（TBIL；mg/dL）、コレステロール（CHOL；mg/dL）、トリグリセリド（TRIG；mg/dL）。各バーには、4回分の反復データが含まれます。

図8.Invivofectamine 3.0 Reagentを投与したマウスから採取したサンプルのサイトカイン分析。FVIIをターゲットとするAmbion in vivo siRNAとInvivofectamine 3.0 Reagentとの複合体を、0.25 mg/kg（デキサメタゾン（Dex）の添加および添加無し）の用量でマウスへ投与しました。投与から2、6、24、48時間後に血液サンプルを採取し、マルチプレックスビーズベースのイムノアッセイキットを用いてサイトカインのレベルを測定しました。コントロールとして、未処理の個体からのサンプルを同一のサイトカインパネルアッセイで測定しました。各バーには、3回分の反復データが含まれます。