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レンチウイルスおよびアデノウイルスのRNAiベクターによる導入
核酸をさらに確実に導入したい場合は、ウイルスは核酸を入れるのが困難な細胞タイプでのタンパク質の過剰発現またはノックダウンために核酸を届ける手段です。 アデノウイルス、オンコレトロウイルス、およびレンチウイルスのベクターは培養細胞とin vivoのデリバリーに広く使用されています(表1)。
表1 - あなたの実験にもっとも適したウイルス系の選択
| ウイルスシステム | 一過性発現 | 安定発現 | ||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 分裂細胞 | 非分裂細胞 | 分裂細胞 | 神経細胞 | Drug- or growth- arrested cells | Contact- inhibited cells | |
| アデノウイルス |  | | ||||
| レンチウイルス | | | | | | |
| レトロウイルス | | | ||||
アデノウイルスは、ほぼすべての哺乳類の細胞タイプを一過性に形質導入できるDNAウイルスです。 アデノウイルスは、コクサッキーウイルス受容体（CAR）と結合することにより、ターゲット細胞に入り込みます。 CARと結合した後、アデノウイルスはインテグリンを介したエンドサイトーシスを経て内在化し、続いて核に能動輸送されてそのDNAがエピソームとして発現されます。
オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスは、ホスト細胞の染色体に自らのゲノムを安定的に取り込ませるpositive strandのRNAウイルスです。 水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）のような、幅広い親和性を持つ包膜の偽型になると、これらのウイルスは事実上あらゆる哺乳類の細胞タイプに侵入できます。 ただし、オンコレトロウイルスは、細胞分裂の際の核膜の破壊に依存して細胞に形質導入されます。 これとは対照的に、レンチウイルスは活性化された核のインポートパスウェイを使用して分裂しない細胞に遺伝子導入することができる、より融通の利くツールです。
オンコレトロウイルスおよびレンチウイルスは、ホスト細胞の染色体に自らのゲノムを安定的に取り込ませるpositive strandのRNAウイルスです。 水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）のような、幅広い親和性を持つ包膜の偽型になると、これらのウイルスは事実上あらゆる哺乳類の細胞タイプに侵入できます。 ただし、オンコレトロウイルスは、細胞分裂の際の核膜の破壊に依存して細胞に形質導入されます。 これとは対照的に、レンチウイルスは活性化された核のインポートパスウェイを使用して分裂しない細胞に遺伝子導入することができる、より融通の利くツールです。
アデノウイルスのシステム
- 分裂および非分裂細胞の効果的な遺伝子導入方法
- 一過性の高発現での遺伝子ノックダウン
- 確実で、再現性のある遺伝子導入方法
- 誘導性または恒常性ノックダウン
レンチウイルスのシステム
- 分裂および非分裂細胞の効果的な遺伝子導入方法
- 安定発現での長期遺伝子ノックダウン
- 再現性のある遺伝子導入方法
- 誘導性または恒常性ノックダウン
レンチウイルスおよびアデノウイルスRNAiベクターの概要では、RNAiを行う細胞タイプを選択します
多くの疾患モデルで頻繁に利用される細胞である、免疫系細胞や初代細胞などは、トランスフェクションが困難です。 RNAiベクターのウイルスデリバリーは、そのような細胞タイプだけでなく in vivo アプリケーションでのトランスフェクションの代わりとなります。 細胞集団におけるRNAiベクターのノックダウンの効果を正確に測定するため、RNAiベクターをできるだけ多くの細胞にデリバリーすることが重要です。 そうしなければ、定量リアルタイムPCR (qRT-PCR)やウエスタン解析によりノックダウンを測定した時、トランスフェくションされていない細胞のmRNAやタンパク質のバックグラウンドがノックダウンを実際よりも非効率的に見せてしまいます。 ウイルスデリバリーは、トランスフェクションが難しい細胞、初代細胞、非分裂細胞など、ほぼ全ての哺乳類細胞タイプで最善の選択になります。 Conveniently, lentiviral delivery systems are available for both shRNA and miR RNAi vectors, and an adenoviral delivery system is available for shRNA vectors (Table 2).
両方のRNAiウイルスシステムの使用手順(図1):
- Clone the double-stranded DNA oligo encoding an shRNA or miR RNAi into one of the BLOCK-iT™ entry (shRNA) or expression (miR RNAi) vectors.
- Gateway® の組換えによってRNAi カセットをアデノウイルス (shRNAのみ) または レンチウイルスデスティネーションベクターに移入します。
- RNAi ベクターをウイルス産生細胞に導入し、ウイルス株を産生します。直ぐに使用できますが、–80°Cで保存することもできます。
- ウイルス上清を収集し、タイターを決定する (必要に応じてアデノウイルスを増幅)
- レンチウイルスまたはアデノウイルスを細胞に感染させる
)
図1. How the BLOCK-iT™ Lentiviral RNAi System works
The product manuals for the Adenoviral and Lentiviral expression systems have more detailed protocols for generating and titering Adenoviral and Lentiviral stocks.
形質導入を成功させるための最初の手順は、実験目的のためのシステムを選択することです（表1）。 Invitrogen provides kits to clone and produce adenoviral and lentiviral stocks as well as offering services to clone these viral vectors and produce the viral stocks. The BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Vector system and the BLOCK-iT™ shRNA vector system are not compatible with each other and employ different lentiviral and adenoviral vector backbones. お客様のmiR RNAiまたはshRNAシークエンスを、レンチウイルスもしくはアデノウイルスに入れると、ウイルスストックの産生は両方のベクターシステムと同じプロトコールに従って行えます。
表2 - レンチウイルスまたはアデノウイルスのRNAiシステムを選択します
| 製品またはサービス | 使用するとき | 主な利点 |
|---|---|---|
| レンチウイルスによる導入 | ||
| BLOCK-iT™ HiPerform™ Lentiviral Pol II miR RNAi Expression System with EmGFP |
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| BLOCK-iT™ Lentiviral Pol II miR RNAi Expression System |
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| BLOCK-iT™ Lentiviral Pol II miR RNAi Expression System with EmGFP |
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| BLOCK-iT™ Inducible H1 Lentiviral RNAi System |
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| BLOCK-iT™ Lentiviral RNAi Expression System |
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| レンチウイルス クローニング &レンチウイルス作製サービス |
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| ViraPower™ レンチウイルス パッケージング ミックス |
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| アデノウイルスによる導入 | ||
| BLOCK-iT™ Adenoviral RNAI Expression System |
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| ViraPower™ アデノウイルス Gateway® 発現キット |
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| アデノウイルスクローニング & アデノウイルス作製サービス |
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