pcr引物退火温度-赛默飞 | Thermo Fisher Scientific

引物通用退火温度介绍

引物退火是聚合酶链反应或 PCR 中的关键步骤。在该步骤中，引物与靶 DNA 侧翼序列结合，进行扩增。该步骤的退火温度应根据所选引物的解链温度确定，确保引物结合和靶标扩增的特异性。（了解更多：PCR 设置和循环参数）

PCR 退火步骤存在的挑战？

PCR 引物的建议解链温度通常介于 55-70℃ 范围内，退火温度通常比Tm值低5℃ 。由于引物序列、长度和组成存在差异，因此，不同的引物通常很难具有相似的解链温度（T_ms）。在这种情况下，具有较高 T_m 的引物可能会非特异性结合靶标，而具有较低 T_m 的引物难以在为这些引物选择的退火温度下发生结合（图 1）。这将大大降低 PCR 的产量和特异性，甚至导致 PCR 实验失败。

图 1.在未优化的情况下，引物在 60℃ 下结合不佳。在典型 PCR 分析中，T_m >60°C 的引物可能结合非靶标序列，而 T_m <60°C 的引物只能部分结合或无法结合靶标。

为了成功进行 PCR 以获得最大产量和特异性，应优化每个引物对的退火温度（图 2）。优化过程可能很长且繁琐，尤其当使用不同的引物组扩增多个 DNA 靶标时。

图 2.基于退火温度进行 PCR 优化。在梯度PCR仪上以 2 ℃ 的增量设置梯度温度，优化退火温度。在本例中，最佳退火温度为 56℃。

如何克服与 PCR 退火相关的挑战？

为了帮助简化和节省 PCR 分析时间，Thermo Fisher Scientific 开发了含创新缓冲液的新一代 Invitrogen Platinum DNA 聚合酶，允许使用通用退火温度 60℃。该缓冲液含共稳定组分，增加了退火步骤中引物-模板结合的稳定性（图 3）。

图 3.Platinum PCR 产物中的引物结合（使用通用退火缓冲液）。即使解链温度与 60℃ 退火温度不同，该稳定组分也可以使引物与 DNA 模板发生特异性结合。

通用退火缓冲液的这一创新特性能够避免计算每个引物对的退火温度，同时不影响 PCR 的产量和特异性（图 4）。

图 4.使用通用退火温度 60℃ 进行高特异性和高产率 PCR 扩增。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶和具有一定退火温度范围的引物组，以 60℃ 的退火温度扩增人基因组 DNA 中的 12 个靶标。所述退火温度使用 T_m计算器计算，用于 Platinum SuperFi DNA 聚合酶。分子量标准（M）：Invitrogen TrackIt 1 Kb Plus DNA 分子量标准。

通用退火还能带来什么优势？

我们很高兴您提出这个问题！通用退火的创新特性还允许同时扩增不同长度的扩增子。通常，不同靶标长度的扩增需要不同的延伸时间，因为过长的延伸时间通常会导致非特异性扩增。但是，通用退火缓冲液中的稳定组分可为引物-模板结合体提供稳定性。从而可以按最长片段的延伸时间来扩增不同长度的片段，同时不影响特异性（图 5）。

图 5.通用退火功能可实现短片段和长片段的同时扩增。使用 Platinum II Taq 热启动 DNA 聚合酶（具有通用退火特性）或另一种热启动 DNA 聚合酶（不具有通用退火特性）从人基因组 DNA 中扩增出四个不同长度的靶标。所有四个靶标使用同一 PCR 方案，并标明了退火和延伸设置。分子量标准：Thermo Scientific ZipRuler Express DNA 分子量标准 2。

通过这种方式，使用通用退火温度可在同一程序（而不是顺序运行）中同时运行不同的 PCR 检测（图 6）。这有助于您节省大量时间并简化 PCR 方案，尤其当需要使用不同的引物组检测多个序列时。

图 6.通过同时扩增和通用方案节省时间。由于引物退火温度和延伸步骤不同，常规方案中的 PCR 检测需要通过顺序运行来扩增不同长度的靶标。借助具有通用退火特性的 Platinum DNA 聚合酶，可以使用通用方案在引物退火温度（60℃）和按最长片段计算的延伸时间下，同时完成不同的 PCR 检测。