如何快速进行小鼠基因分型— 6 个 PCR 技巧

一小时内获取样品的基因分型结果

转基因小鼠在基础研究中广泛用作模型生物，用于研究基因在发育、生理学和人类疾病中的作用。PCR 是一种常见的基因分型方法，用于检测转基因小鼠中目标基因是否存在。

基因分型 PCR 可能很耗时，但你通常希望快速获得分析结果以快速进行下游实验。在此，我们提供了六个简单的 PCR 技巧，帮助您克服小鼠基因分型中的常见障碍。这些技巧也可能适用于其他生物的基因分型，例如果蝇、斑马鱼和拟南芥。

技巧 1：跳过基因组 DNA 提取

传统做法是从小鼠组织样品中纯化基因组 DNA 进行基因分型 PCR 。即使使用快速提取试剂盒，该过程也可能至少需要 0.5–1 小时，并需要使用离心机和加热等实验室专用设备。还需要使用提取试剂，其中一些可能需要进行适当处理。

图 1.常规 PCR 与直接 PCR 的工作流程。在直接 PCR 方法中，不需要基因组 DNA 提取和纯化步骤。

好消息是，我们提供直接 PCR 试剂盒，允许您将组织样本直接用于 PCR 反应扩增。无需进行 DNA 纯化，或使用特殊设备和其他试剂处理（图 1）。直接 PCR 使用原始样品（例如剪尾巴、耳打孔或毛囊发）即可进行实验，从一开始就为您节省了大量时间（图 2）。

图 2.使用多种小鼠组织样本进行直接 PCR 分析。使用 Invitrogen Platinum Direct PCR 通用预混液从组织直接扩增 0.3 kb 和 3.6 kb 片段。样本量依照推荐指南。分子量标准（M）： Invitrogen TrackIt 1 Kb Plus DNA 分子量标准。

您可能想了解如何保存样本供以后使用。实际上，可以长期保存裂解样本 DNA 以便后期使用（图 3）。

图 3.Platinum 直接 PCR 通用预混液裂解方案。在裂解方案中，首先将推荐大小的样本在室温和 98℃（每个〜1 min）下裂解，然后将裂解物储存在 4℃--20℃ 下。

特别建议：如果采取粗提方案，可选择对普通 PCR 抑制剂具有高耐受性的 DNA 聚合酶进行有效扩增。

技巧 2：花更少的时间来优化 PCR 退火温度

众所周知，PCR 优化可能很痛苦。如果使用多组引物，找到最佳退火温度是一个繁琐的过程。更糟糕的是，如果退火温度相差很大，可能无法在同一模块进行 PCR 反应。这可能意味着每次运行之间都需要很长时间。

幸运的是，我们提供的直接 PCR 预混液具有通用退火特性。也就是说您可以使用 60℃ 作为引物的退火温度。节省了大量计算退火温度的时间和在各个模块上运行检测的时间。（图 4）。

图 4.通用退火特性可节省时间。借助使用通用引物退火的DNA 聚合酶，使用一种程序即可在同一模块上对不同Tm值的引物同时进行 PCR 。

技巧 3：使用的试剂管更少

PCR 反应包含多种组分，例如缓冲液、酶、dNTP、MgCl₂、引物和 DNA 模板。这意味着 PCR 实验配置可能非常耗时且易于出错，并且存在试剂污染的风险。使用含 PCR 所需成分的预混液可以消除所有这些障碍。您只需添加引物和组织样本（图 5）。

图 5.直接 PCR 预混液的简便性。只需将引物和 DNA 来源样本添加到 PCR 预混液中即可进行反应。

特别建议：根据要检测的基因，单个反应可以包含多个引物对（即多重 PCR）。如图 6 所示，单个反应可成功检测多达五个靶标。节省了大量时间，且不必设置多个反应。请注意，一开始可能需要适当进行引物设计和优化才能进行多重检测。

图 6.直接 PCR 的多重检测。使用 Platinum 直接 PCR 通用预混液，可以从小鼠尾巴中直接扩增出五个 0.1-1.1 kb 片段，实现单重至 5 重反应。

技巧 4：在几分钟而不是几小时内完成 PCR 反应

没有人希望 PCR 需要很长的时间完成。值得庆幸的是，可以从以下三个方面来缩短 PCR 反应时间，依次从影响大小来看：

寻找快速 PCR 酶，可以以 15–20 sec/kb 的速度合成 DNA（而不是 60 sec/kb）的酶。
结合使用快速PCR仪，例如可以快速升高或降低至所需循环温度的PCR仪（例如，6 sec/°C）。
选择“快速”耗材产品（若仪器适用），低容的耗材高度更低，最大程度减少了蒸发的影响并提高热传导效率，而超薄的壁可实现更好的热传递。

使用“快速”PCR酶、PCR仪和耗材产品在短短 40 分钟内扩增 ≤1 kb 的片段（图 7）。

图 7.快速循环，缩短 PCR 运行时间。使用 Platinum 直接 PCR 通用预混液（P）（以 20 sec/kb 的速度合成 DNA）和其他供应商的直接 PCR 试剂盒（A–K），进行 35 次循环，扩增 1 kb 片段

技巧 5：直接将 PCR 产物上样至凝胶

传统方法是在将PCR产物上样至凝胶进行电泳之前，需要将上样染料添加到 PCR 产物中。这个过程看似微不足道，但涉及到计算所需体积、制备上样染料、吸取 PCR 样品，最后进行混合。这些步骤需要时间，更不用说处理操作期间产生的额外塑料废物了。推荐您选择使用已包含直接凝胶上样所需染料的直接 PCR 预混液（图 8。