细胞活力/活性检测

细胞活性是指样本中健康的活细胞数量（1）。细胞活性检测用于测量细胞响应胞外刺激、化学试剂或疗法处理的物理和生理健康情况（1,2,3），或者用于确定细胞培养的最佳生长条件。

赛默飞世尔科技可提供种类齐全的细胞活性检测研究工具，如下方选择指南所示。大多数检测试剂盒可在多种检测平台上使用，包括荧光显微镜、流式细胞仪和酶标仪。每种检测试剂盒均包含一种专门设计的试剂。该试剂基于细胞膜完整性（膜完整性染料）或细胞功能（如酶活性（酶活性底物）或代谢活性（代谢活性试剂）来检测细胞活性。每种活力检测试剂均可提供细胞死活的单一参数读值。也可使用多参数检测（细胞活性检测试剂盒），对细胞健康状况进行多个指标的检测。这些活性检测试剂盒可同时检测活细胞、死细胞和受损/即将死亡的细胞。细胞活性检测试剂盒提供的细胞健康状况信息比单一参数读值方法的更多。

膜完整性是细胞活性检测中的常用检测指标。膜完整性染料不会透过细胞，只能通过受损的细胞膜进入细胞。该染料不能穿透活细胞未受损的质膜。膜完整性活性染料包括：

• 核酸染料（本节）：这些活性染料在水介质中不发荧光，但与双链 DNA（dsDNA）或 RNA 结合后，荧光会增强。核酸活性染料包括 SYTOX 死细胞染料、碘化丙啶和 7-氨基放线菌素 D（7-AAD）。
• 氨基染料（下一节）：膜完整性活性染料（氨基染料）：这些活性染料可与位于细胞内外的细胞蛋白上的伯胺基团共价结合。只与细胞表面的氨基蛋白结合时，仅产生微弱的信号；然而，当染料通过受损的质膜进入细胞并与细胞内部的氨基蛋白反应时，产生的信号非常强。氨基活性染料包括用于流式细胞仪的 LIVE/DEAD 可固定死细胞染料。

PI 和  7-AAD 是流式细胞仪常用的具有代表性的 DNA 结合染料；然而，两者也可用于荧光显微镜。

PI是一种核酸和染色质染料，常用于检测死细胞。在水溶液中，PI的激发/发射光谱为493/636 nm；但是结合DNA后，其荧光会提高20-30倍，激发/发射光谱值在535/617 nm。这种染料通常与凋亡检测染料（如annexin V）联合使用；更多信息见以下细胞活性检测试剂盒一节。加入 RNase 后，PI 还可用于固定细胞的 DNA 含量检测，进行细胞周期分析（图 1）。

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7-AAD也是一种核酸和染色质染料，在结合DNA后发生光谱变化。它能选择性结合DNA的GC区域，显现出独特的带型，以进行染色体带型研究。7-AAD也能用于流式细胞周期分析中，适用于已固定和破膜的细胞。

图 2.小麦根尖细胞周期的7个阶段 。7-氨基放线菌素 D 共聚焦显微图片展示了细胞周期的 7 个阶段中的小麦根尖细胞。使用 7-氨基放线菌素 D 对 DNA 进行染色，使用抗-ß-微管蛋白一抗及荧光素标记的二抗标记微管。细胞宽度从约 15 微米到 25 微米左右不等。这些阶段为（从左边最上方开始）：分裂间期的周质微管列阵、微管的早前期带（预示着未来的分裂面）、中期有丝分裂纺锤体、末期（呈现出早期成膜体与细胞板）、在细胞分裂中完全成形的成膜体、细胞分裂晚期（分裂面与早前期带吻合）；子代细胞中周质微管的复原。该图片由澳洲国立大学生物科学研究院植物细胞生物组B.E.S. Gunning提供，且从Gunning, B.E.S. and Steer, M.W., Plant Cell Biology: Structure and Function, Jones and Bartlett Publishers (1995)该文章中得到许可。

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SYTOX 死细胞染料是一种易于使用的非细胞通透性染料，与 dsDNA 结合后荧光增强。在细胞中使用这些活性染料无需额外的洗涤步骤，并且由于其在水介质中不发荧光，背景染色极低。这些染料具有多种单一颜色可供选择，并与多种激光器兼容，可灵活应用于多种实验和不同检测平台（包括荧光显微镜（图 3）、流式细胞仪（图 4）和微孔板）。

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氨基反应性活性染料为非细胞通透性，并可与细胞的氨基蛋白发生反应。在活细胞中，这些染料与细胞外的伯胺结合，并发出微弱的荧光；在死细胞中，这些染料与细胞内的氨基蛋白结合，使得细胞荧光显著增强。由于染料是与细胞蛋白共价结合，样本可被固定和透化，而不会失去其活性染色模式。

Image-iT DEAD 绿色染料（图 5）是另一种易于使用的非细胞通透性膜完整性染料，用于识别死细胞。 这种活性染料可用于待固定和/或透化的细胞，并可同时使用其他荧光染料进行多重实验。

图5.单通道活性检测的多重分析。用喜树碱处理HeLa 细胞,并用 Hoechst 33342（蓝色通道）染色，用于总细胞计数，而死细胞用 Image-iT DEAD Green（绿色通道）染色。
 

LIVE/DEAD 可固定死细胞染料是一种非细胞通透性、可与氨基反应的死细胞染料，最适合用于待固定和/或透化的细胞。这些染料专用于在流式细胞仪中测定细胞活性（图 6）。LIVE/DEAD可固定死活染料系列包含了多种单色染料，适用于各种激光器，满足多参数实验需求。

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图 6.细胞固定后，LIVE/DEAD可固定细胞活性染料的染色模式可以保持。LIVE/DEAD 可固定水绿色死细胞染色试剂盒用于对活细胞（左侧峰）和热处理 Jurkat 细胞（右侧峰）的混合物进行差异染色。(A) 中的细胞没有固定；(B) 中的细胞在 3.7% 福尔马林中固定后进行染色。在流式细胞仪上采用 405 nm 激发波长及 ~525 nm 发射波长分析样品。

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酶活性底物是一种不自发荧光的荧光试剂，可与活细胞中的细胞酶或受损细胞释放的细胞酶反应而发出荧光或显色。酶活性底物包括：

• Cell Trace Calcein AM 染料：这些活性染料是细胞通透性荧光底物，可与活细胞中的胞内酶反应而发出荧光。在活细胞中，AM 基团会被活性酯酶切割，然后发出荧光。该 AM 基团不能在死细胞中被切割。Calcein AM 染料是短时间染色的理想选择，因为可在几小时内将染料运输出细胞。
• CyQUANT 细胞毒性检测：这些活性检测试剂用于检测受损细胞释放的细胞外葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）或乳酸脱氢酶（LDH）。CyQUANT 细胞毒性检测试剂盒（G6PD 释放检测）和 CyQUANT LDH 细胞毒性检测-荧光法试剂盒分别对 G6PD 或 LDH 进行荧光检测，通过酶促过程，将刃天青还原成带红色荧光的试卤灵。CyQUANT LDH 细胞毒性检测是一种显色检测方法，通过酶促过程来检测 LDH，从而形成红色甲臜产物。

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CellTrace Calcein AM 染料是细胞通透性底物，用于鉴别活细胞。这些底物可测量酶活性和膜完整性。活细胞的酶活性使酯酶能够切割 AM 基团，并产生荧光，而活细胞的完整细胞膜是细胞内保留荧光染料的必需条件。这些染料具有蓝色、紫色和绿色荧光可供选择，可灵活用于多重实验，通过荧光显微镜、共聚焦显微镜（图 7）或流式细胞仪分析（图 8）。

图 7.用 Calcein AM 和 FluxOR Red 试剂处理原代大鼠皮层神经元（A1084001）。刺激钾通道后，通过 FITC/Alexa Fluor 488 滤光片组进行成像来分析细胞活性，以检测 Calcein AM 的绿色荧光发射情况（左上图）。使用 FluxOR Red 和 TRITC/Alexa Fluor 555 滤光片组检测钾离子流（右上图）。Calcein AM 和 FluxOR Red 的叠加证实了细胞活性和钾离子流（下图）。
 

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LIVE/DEAD紫激光细胞活性试剂盒有双色荧光染料，能够测量两个细胞健康的参数：通过细胞浆膜完整性检测死细胞，通过胞内酯酶活性检测活细胞（图9）。CellTrace Calcein Violet AM 及 LIVE/DEAD 可固定水绿色荧光染料是该应用的最佳选择；这两种染料均利用紫色激光，使得其他激光可用于检测其他荧光染料。

CyQUANT LDH 细胞毒性检测试剂盒适用于检测受损或死亡细胞中的细胞毒性，简单且可靠。CyQUANT LDH 细胞毒性检测（图 10）基于比色法来定量细胞毒性；而 CyQUANT LDH 细胞毒性检测- 荧光试剂盒（图 11）基于荧光法来检测细胞毒性。两种 LDH 细胞毒性检测试剂盒均可准确且定量分析细胞外乳酸脱氢酶（LDH），这是一种存在于许多不同细胞类型（包括三维细胞模型）中的胞浆酶。这些试剂盒还可用于监测同一样本内细胞毒性随时间的变化。

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图 10.CyQUANT LDH 细胞毒性检测试剂盒可获得高线性度结果。使用含血清的完全培养基将 A549（贴壁）、Ramos（悬浮）或 HCASMC（人冠状动脉平滑肌原代）细胞铺在 96 孔板中。培养过夜后，使用水（自发 LDH 释放测定）或 10 倍裂解液（最大 LDH 释放测定）对各种细胞进行处理。处理后，取出培养基并放入 96 孔板中。按照制造商的说明，使用 CyQUANT LDH 细胞毒性检测试剂盒来测定 LDH 释放到培养基中的量。对于所测的各种细胞类型，释放和检测到的 LDH 量与每孔细胞数量具有很好的相关性。
 

图 11.CyQUANT LDH 细胞毒性检测-荧光法试剂盒可获得高线性度结果。使用含血清的完全培养基将 A549（贴壁）、Ramos（悬浮）或 HASMC（人动脉平滑肌原代）细胞铺在 96 孔板中。培养过夜后，各种细胞未经处理（自发和内源性 LDH 背景测定）或使用 10 倍裂解液进行处理（最大 LDH 释放测定）。处理后，取出培养基并放入 96 孔板中。使用 CyQUANT LDH 细胞毒性检测-荧光法试剂盒或 CyTox-ONE 均质膜完整性检测试剂盒（Promega）来测定 LDH 释放到培养基中的量。检测到的 LDH 量与每孔细胞数量具有很好的相关性。CyQUANT LDH 细胞毒性检测中高度纯化的刃天青产生的荧光信号增强 3 倍以上。
 

CyQUANT 细胞毒性检测试剂盒（G6PD 释放检测）通过胞浆酶葡萄糖 6-磷酸脱氢酶（G6PD）从受损细胞释放到细胞培养基中来监测细胞毒性（图 11）。这种快速细胞毒性检测方法可在不到一小时内完成，并且其灵敏度足够高，仅需 500 个细胞即可检测。

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细胞代谢活性检测试剂盒是具有膜透过性的活细胞检测试剂，可检测各种细胞参数，如细胞氧化环境或氧化还原电位。代谢活性检测试剂包括：

• alamarBlue/alamarBlue HS 和 PrestoBlue/PrestoBlue HS 细胞活力检测试剂：这些试剂加入后即可读数、是可通透细胞的基于刃天青的溶液，利用具代谢活性细胞的还原能力来测量细胞活性。在活细胞中，将刃天青还原为红色强荧光的试卤灵，可在光吸收或荧光酶标仪上检测到。alamarBlue HS 和 PrestoBlue HS 通过优化的纯化过程，可去除各种污染物，使得背景荧光减少 >50%，信噪比提高 >100%。这两种检测试剂均无毒，也不需要细胞裂解，因此，可去除试剂后替换为完全生长培养基，进行下一步细胞培养。
• Vybrant 细胞代谢检测试剂盒：该试剂盒通过将 C₁₂-刃天青还原成红色荧光 C₁₂-试卤灵来测量细胞活性。C₁₂-刃天青，是亲脂版本的刃天青，对活细胞的通透性更强，还原的 C₁₂-试卤灵产物比非亲脂版本的刃天青保留得更好。与单独使用刃天青相比，这样产生的信号更强且检测限更好。
• CyQUANTMTT 和 XTT 细胞活性检测：这些活性检测试剂盒是完整和优化的试剂盒，可基于活细胞中的细胞氧化还原电位来显色检测细胞活性。在这个代谢过程中，MTT 被转化为不溶性紫色甲䐶产物，而 XTT 被转化为水溶性橙色甲䐶产物。在光吸收酶标仪上，可检测到这两种产物。

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alamarBlue 和 alamarBlue HS 是即用型试剂，用于检测细胞的代谢活性。 AlamarBlue HS试剂的纯度更高，可减少背景噪音并提高荧光信噪比（图 12），它是细胞活性深度研究或高细胞密度应用的理想选择。两种细胞活性检测试剂均具有高灵敏度，alamarBlue 可检测低至 50 个细胞/孔，而 alamarBlue HS 可检测低至 20 个细胞/孔。alamarBlue 试剂和alamarBlue HS 试剂都适用于基于荧光或光吸收度的酶标仪。

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PrestoBlue 和 PrestoBlue HS 是即用型试剂，用于检测细胞的代谢活性。PrestoBlue HS 试剂的纯度更高，可减少背景噪音并提高荧光信噪比（图 13）。需要快速测定细胞活性时建议使用 PrestoBlue HS，因为只需培养 10 分钟即可进行检测。PrestoBlue HS 具有高灵敏度，可检测低至 10 个细胞/孔。PrestoBlue 试剂和PrestoBlue HS 试剂都适用于基于荧光或基于光吸收度的酶标仪。

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Vybrant 细胞代谢检测试剂盒通过将非荧光 C₁₂-刃天青还原为荧光 C₁₂-试卤灵来测定细胞活力，荧光试卤灵信号与活细胞数量成比例。刃天青无毒性，可持续监测细胞活性，并与其他荧光染料联用。最终可在酶标仪或流式细胞仪上测量细胞代谢活性（图 15）。

CyQUANT MTT 是一种成熟且普遍使用的比色检测方法，基于活细胞中的细胞氧化还原电势来测定细胞活力。代谢活性细胞将水溶性 MTT 试剂转化为不溶性紫色甲䐶产物。通过测量 570 nm 处的吸光值，可在酶标仪上检测到该产物（图 16）。

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CyQUANT XTT 是一种高重现性的比色检测方法，基于活细胞中的细胞氧化还原电势来测定细胞活力。代谢活性细胞将水溶性 XTT 试剂转化为水溶性橙色甲䐶产物。通过测量 450 nm 处的吸光值可在酶标仪上检测到该产物（图 17）。

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图 17.CyQUANT XTT试剂盒适用于各种细胞类型。将 A549（贴壁）、Jurkat（悬浮）或 HASMC（人主动脉平滑肌原代细胞）以 10000、5000、1000 或 0（用作对照）细胞/孔的浓度铺在 96 孔板中。培养过夜后，使用 CyQUANT XTT 细胞活力检测来测定细胞活力。添加 XTT 试剂/电子偶联剂混合物，并在 37℃ 的 CO2 培养箱中孵育细胞 4 小时。使用 Varioskan LUX 酶标仪在 450 和 660 nm 处读取吸光值。测定特定吸光值信号。

即用型活性染料以方便的滴瓶形式提供易于使用的液态制剂，满足您的日常细胞活力检测需求。这些试剂在室温下性质稳定，可存放在您的操作台、显微镜或流式细胞仪旁边，以便于取用。无需洗涤即可使细胞快速染色，便于在整个实验中使用。

ReadyProbes 试剂可选择蓝色和红色荧光，用于荧光显微镜（图 18）和流式细胞仪。在多参数试剂盒中也提供这些试剂（见细胞活性检测选择指南）。

即用型流式试剂在流式实验中适用于检测细胞活性（图 19），其中的蓝光、绿光、黄光和红光激发的染料可加入到多色流式实验中。

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这是一种便捷的包含多种染料的多参数检测试剂盒。细胞活力检测试剂盒可通过检测活细胞和死细胞的膜完整性、或者通过结合细胞功能和膜完整性的检测来方便地测定活力。每个试剂盒还可与其他荧光染料共用。

7-AAD 和 PI 可与膜联蛋白 V 一同用于区分早期凋亡细胞与死细胞（图 20，图 21）。使用荧光标记的膜联蛋白 V 来分析早期凋亡情况。膜联蛋白 V 可检测细胞膜上磷脂酰丝氨酸的表达，而添加 7-AAD 或 PI 可鉴别死亡和焦亡细胞。

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图 20.使用 PI 和膜联蛋白 V 鉴别凋亡细胞。使用 10 μM 喜树碱处理Jurkat 细胞（T 细胞白血病，人） 4 小时（右图）或未经处理（作为对照，左图）。然后用膜联蛋白V Alexa Fluor 488偶联物和碘化丙啶染色，分别用以检测细胞凋亡和死亡，接着进行流式细胞分析。结果显示，经喜树碱处理的细胞（右图）后，凋亡细胞（用“A”表示）比例明显高于对照组（左边）。V = 活细胞，D = 死细胞。
 

HCS 线粒体健康试剂盒（图 22）可测量两个重要的细胞健康参数：线粒体毒性和细胞毒性。通过 MitoHealth 染料来测量线粒体毒性。MitoHealth 染料可检测线粒体膜电势变化，电势丧失将导致信号丧失。通过 Image-It DEAD Green 测量细胞毒性。Image-It DEAD Green 是一种非细胞通透性染料，可穿过死细胞或染色细胞受损的质膜与 DNA 结合，变成强荧光。Hoechst 3342 是一种细胞核蓝色荧光染料，可与活细胞和死细胞中的 DNA 结合。

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图 22.细胞丢失、线粒体膜电势和质膜渗透性的多重分析。将 HepG2 细胞置于胶原包覆平板上，用各种剂量的缬氨霉素处理 24 小时，并用 Image-iT DEAD Green 和 MitoHealth 染料（HCS 线粒体健康试剂盒的组分）染色 30 分钟。然后，固定细胞并用 Hoechst 核染料复染。在 Thermo Scientific Cellomics ArrayScan VTI 上进行成像和分析。（A）以选定浓度的缬氨霉素进行成像。（B）使用缬氨霉素浓度计算细胞死亡数、线粒体膜电势和细胞质膜通透性的EC₅₀值。

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LIVE/DEAD 细胞活力检测基于膜完整性、酯酶活性和/或结构分段，同时检测活细胞和死细胞群。这些基于荧光的检测适用于细胞、细菌、酵母菌和真菌。可在一个或多个检测平台上使用这种检测试剂盒，包括荧光显微镜、流式细胞仪或酶标仪。每个试剂盒均包含荧光染料，范围从蓝色到近红外发射光谱，具有多重分析功能。

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