Attune 流式细胞仪样本数据

使用氯化铵裂解的陈旧人全血标本 (AllCells)。图像处理是使用 Cells_Half_Resolution_v22 模型完成的。显示的统计数据为门内细胞百分比。

对黏性较高的 CEN 细胞进行准确设门

CEN 细胞按厂家说明书 (BD) 用 PI 进行染色后，在 Attune CytPix 成像型流式细胞仪上以 100 μL/分钟的流速进行数据采集。在 PI 直方图上，最初绘制门控时将每个峰两侧的肩缝包含在内（CEN 设门策略 1，顶部中间），预期门 I 包含单个细胞、门 II 包含双联体，之后依此类推。但是，在门 I 内捕捉到了内双联体的图像（左图）。 将门边界向左移以排除每个峰的右肩（CEN 设门策略 2，右图），有效地将单个细胞和黏连体分入了正确的门内。

Ramos 细胞培养的污染情况

在一次常规传代检查时，培养物中的 Ramos（淋巴瘤）细胞显示细胞计数和存活率减少，尽管看起来是在融合。进一步调查显示有微生物污染，且通过 Attune CytPix 流式细胞仪的成像和反向设门得到证实 (A,B)。这种污染的早期迹象 (C) 最初被误认为碎片。

检测 PBMC 中稀有的 ILC2 细胞亚群

(A) 用 100 μL PBS (+10% FBS) 重悬 1 x 10⁶个 PBMC 细胞。用 Invitrogen FITC 标记的预混白细胞谱系标志物（lineage cocktail，包含 CD2、CD3、CD14、CD16、CD19、CD56 和 CD235a）、CD123-FITC 和 CRTH2-Alexa Fluor 647 流式抗体进行染色。ILC2 细胞被定义为 lineage (BL1) 阴性，CRTh2 (RL1) 阳性细胞群。(B) CRTH2 细胞是一类在 Th2 细胞上表达趋化受体同源分子的细胞。CRTH2 分子是与一种异源三聚体 G 蛋白偶联的七重跨膜蛋白，也是前列腺素 D2 受体，主要在 Th2 细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞上表达。CD294 分子可抑制 Th2 细胞凋亡，并介导表达 CRTH2 的细胞向过敏性炎症部位（例如哮喘肺）的趋化作用。(C) ILC2 细胞的表型为 lineage 阴性和 CRTH2 阳性。在本例中，ILC2细胞亚群仅占淋巴细胞的 0.016%。数据由莱斯特大学的 David Cousins 提供。

CAR T 细胞杀伤靶向淋巴瘤细胞的成像结果

分别使用 CellTrace Far Red 和 CellTrace Violet 标记 CAR T 和 Ramos 细胞，在 37°C 下 1:1 培养 1 小时。调整细胞浓度为 >8 x10⁵ 个细胞/mL，以 200 μL/分钟的流速在 Attune CytPix 成像型流式细胞仪上采集未过滤的样本。第一象限（左上）、第四象限（右下）和第三象限（左下）分别为单个 Ramos 细胞、CAR T 细胞和碎片。第二象限的图像（两种染料均为阳性，右上）显示两种细胞类型融合在一起，是由于CAR T 细胞吞噬了 Ramos 细胞而作为单个细胞进行采集。

CAR-T 细胞杀伤靶向淋巴瘤细胞的成像结果。

分别使用 CellTrace Far Red 和 Violet 标记 CAR-T 和 Ramos 细胞并以 1:1 比例在 37°C 下孵育1小时。在 Attune CytPix 成像型流式细胞仪上以 200 μL/分钟、>8 x 105 个细胞/mL 的设置采集未过滤样本的图像。第一象限（左上）、第三象限（右下）和第四象限（左下）的图像分别显示单个 Ramos 细胞、CAR T 细胞和碎片。第二象限的图像（对两种染料均呈阳性，右上）显示融合在一起的两种细胞类型，这是作为单个事件采集的，因为 CAR-T 细胞吞噬了 Ramos 细胞。百分比为设门 %。

在细胞图库中，带注释的事件具有黑色轮廓，且带有指示居中定位的黄点。图像处理是采用细胞半分辨率 (Cells Half Resolution) 模型通过分析圆度与强度偏斜度来完成的。这样，我们就能在细胞处于同一视野中但不显示细胞间相互作用的情况下区分黏连细胞的相互作用（CAR-T 细胞与 Ramos 细胞间）与分离细胞的相互作用。

以1,000个细胞/样本的比率将结直肠癌细胞掺入健康人 PBMC 中。所有样本均由 Amsterdam UMC 制备。显示的统计数据为细胞计数。图像处理是使用 Cells_Half_Resolution_v22 模型完成的。

感染的 293T-ACE2 细胞中 SARS-CoV-2 核蛋白染色

(A) 未感染细胞及 (B) 感染 SARS-CoV-2 的 293T-ACE2 细胞在感染 36 小时后，MOI 为 0.1。采用标准实验方案制备细胞，并使用 SARS 冠状病毒核蛋白单抗（克隆号：1C7C7）和 PE 标记的抗小鼠二抗（货号 P852）染色。使用配备自动进样器的 Attune NxT 流式细胞仪进行数据采集。在 FCS Express 7 中进行数据分析。

针对心肌细胞分化过程中转录因子的流式细胞分析。

反映 H9 hPSC 细胞向心肌细胞分化过程中 Oct4 和 Nkx2.5 表达情况的双参数散点图。所有流式图显示的都是单个细胞门。(A) 在第 1 天、几乎所有细胞都是 Oct4⁺/Nkx2.5^-，即呈多能状态。(B–J) 在分化过程中，随着时间的推移，细胞逐渐不表达Oct4 并开始表达心肌标记物Nkx2.5。如上图所示，红色细胞群代表 Nkx2.5⁺细胞，绿色细胞群代表 Oct4⁺细胞。

两种大肠杆菌 CFU 类型的鉴别

大肠杆菌在 37ºC 条件下培养过夜，然后在 4ºC 条件下继续培养3天。使用 Attune CytPix 流式细胞仪以 100 μL/分钟的流速进行样本数据采集。可以从这些图像鉴别两类 CFU：(A) 代表单细胞的短菌落和 (B) 带不完全裂变环的加长结构。各亚群细菌的典型图像如图所示。对所选图像反向设门显示两个亚群在 FSC/SSC 点图上完全不同（橙色点，左）。

数据是使用 532 nm 激光器从植物细胞核中采集的，这些细胞核取自拟南芥 Col-1 叶片组织且用 FxCycle PI/RNase 染色液进行标记。(A) 用侧向散射光与 FxCycle PI/RNase 荧光数据绘制的双参数密度图，发荧光细胞核周围为散射光门。(B) 使用对单体细胞核进行设门的 FxCycle PI/RNase 荧光数据绘制的双参数密度图。(C) 用细胞核设门的细胞群的 FxCycle PI/RNase 荧光数据绘制的对数直方图，不同的峰分别对应 2C、4C、8C 和 16C 细胞核。

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多个位点蛋白敲低效率的筛选

培养人外周血单个核细胞 (PBMCs)，然后使用 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 试剂盒激活 T 细胞。然后使用 Invitrogen TrueGuide Synthetic gRNA、TrueCut Cas9 Protein v2 和 Invitrogen Neon 电转染系统对细胞进行基因编辑。利用 Invitrogen TrueDesign Genome Editor 工具设计针对人 T 细胞受体、β-2 微球蛋白和 CD47 基因的 gRNA。转染 72 小时后，使用流式细胞术分析每个位点的功能性蛋白敲低效果，从而分析细胞的编辑效率。在 Attune NxT 流式细胞仪和 CytKick 自动进样器上获取样本。以上叠加图由 Attune 流式软件生成。每个直方图都叠加了未经 Neon 电转染的细胞对照。所用流式抗体分别是 TCR α/β (IP26) PE (eBioscience)、β-2 Microglobulin (B2M-01) FITC 和 CD279 (PD-1) (eBioJ105 (J105)) APC-eFluor 780 (eBioscience)。

人 PBMC 在 TCR α/β、B2M 和 PD-1 位点蛋白敲低的叠加流式图

培养人外周血单个核细胞（PBMCs），然后使用 Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 试剂盒激活 T 细胞。然后使用 Invitrogen TrueGuide Synthetic gRNA、TrueCut Cas9 Protein v2 和 Invitrogen Neon 电转染系统对细胞进行基因编辑。利用 Invitrogen TrueDesign Genome Editor 工具设计针对人 T 细胞受体、β-2 微球蛋白和 CD47 基因的 gRNA。转染 72 小时后，分别使用流式细胞仪、二代测序、Sanger 测序分析和基因组检测裂解试验分析细胞的编辑效率。所有图表和数据分析均来自于Attune NxT 软件。每个直方图都叠加了未经 Neon 电转染的细胞对照，每个图表均来自于单个板孔采集的数据。所用流式抗体分别是 TCR α/β (IP26) PE (eBioscience)、β-2 Microglobulin (B2M-01) FITC 和 CD279 (PD-1) (eBioJ105 (J105)) APC-eFluor 780 (eBioscience)。

检测同一细胞中表达的多种荧光蛋白

使用 Lipofectamine 3000 转染试剂，通过依次转染每个质粒（上图），或将两个质粒 1:1 (w/w) 混合（下图）共转染的方式，将两个质粒转染至 293FT 细胞。转染细胞生长 48 小时后，收集细胞并上流式细胞仪进行分析。用 Attune NxT 流式细胞仪以 100 μL/分钟的流速获取样本，每个样本采集至少 15,000 个细胞。检测到所有主要细胞群： 表达一种荧光蛋白的细胞、同时表达两种荧光蛋白的细胞和未表达荧光蛋白的细胞（图中显示百分比）。很容易区分表达荧光蛋白的细胞与未表达荧光蛋白的细胞。(A) 分别使用 405 nm 和 561 nm 激光器激发 TagBFP 和 mOrange2。(B) 分别使用 405 nm 和 561 nm 激光器激发 TagBFP 和 mKate。(C) 分别使用 488 nm 和 561 nm 激光器激发 emGFP 和 mKate。

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