Bigfoot 光谱流式细胞分选仪样本数据 | Thermo Fisher Scientific

Bigfoot 光谱流式细胞分选仪的性能和应用数据

性能数据表明，Bigfoot 光谱流式细胞分选仪能够准确并且精确地解析荧光信号。应用数据证明了免疫表型和标记物表达研究所需的选通分辨率和分选纯度水平。

有关其他应用数据，请下载本节和资源页面上列出的应用说明。

23 色免疫表型

免疫表型检测组合是监测疾病和治疗进展的有用工具，它尝试通过将细胞样本还原成其细胞亚群，以了解每个亚群占总白细胞群的百分比。过去，需要在同一细胞样本上运行平行检测组合，才能成功鉴定调节性 T 细胞、NK 细胞、NKT 细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞、B 细胞和 T 细胞的表型。我们能在单个样本上分析的参数越多，就能越进一步地将这些细胞还原成辅助细胞、记忆细胞、活化细胞、衰老细胞或功能细胞亚群。在此数据集中，通过 Ficoll 梯度法纯化全血，进而从健康供体中获得 PBMC。

所用仪器为 7 激光 Bigfoot 光谱流式细胞分选仪，具有以下激光配置：349 nm/405 nm/445 nm/488 nm/561 nm/640 nm/785 nm。在该配置中，445 nm 激光的独特之处在于它能够激发 BUV496 和 BV480，从而增加光谱维度。785 nm 激光可用于鉴别活细胞/死细胞或直接激发 APC-Fire 810。Bigfoot 细胞分选仪的其他独到之处在于各通道均使用 PMT 检测器，并且滤光片采用了与每个激光器分开的配置，可在分选过程中实现极佳的活细胞分解速度和准确性。此外，Bigfoot 还采用了空气激发方法，可在细胞流离开喷嘴时对其进行询问，所有这些都要求流式细胞分析所用检测组合的组分针对 Bigfoot 进行优化，而采用 APD（雪崩光电二极管）或石英杯激发方法对流式细胞进行询问的仪器则不然。

23 色免疫表型检测组合的组分

BUV395	CD14
BUV496	CD16
BUV563	CD8
BUV615	PD-1
BUV661	CD38
BUV737	CD4
SB436	CD45RA
Pacific Blue	CD123
BV480	CD185
BV510	IGM
BV570	CD8
SB600	IgD
SB702	CD127
SB780	CD20
FITC	HLA-DR
PE	CD25
PE-Dazzle	CD197
PE-Cy5	CD56
PE-Cy7	CD196
APC	CD27
NFR710	CD19
APC-eF780	CD3
APC-F810	CD15

从双峰中分离单峰

第一步是用 FSC-A 与 FSC-H 从双峰中分离出单峰。该检测组合的基质是 CD3 (T)、CD19 (B)、CD56 (NK) 和 CD14 (M0) 的组合。然而，为了确保亚群纯度尽可能高，也可使用其他标记物（例如 CD11C、CD20 和 HLA-DR）作为额外的反向设门。对 T 细胞设门时，CD11c、CD20、CD56 和 CD14 均可从分析图中去除。对 B 细胞设门时，可以去除 CD56 和 CD14。对单核细胞设门时，可以去除 CD3、CD56 和 CD20。如果希望 NK 细胞设门获得更好的鉴别效果，那么从 CD3 与 CD56 开始设门将有助于从 NKT 细胞区分出 NK 细胞。这样还可进一步将 T 细胞、B 细胞和单核细胞标记物从分析中去除。

对人 PBMC 群设门分离淋巴细胞。使用 Ficoll 分离法分离健康的 PBMC。使用 Invitrogen CellBlox 封闭缓冲液（货号 B001T06F01）对细胞进行 15 分钟预封闭。每次检测取每种抗体 5 µL，在 4°C 下对细胞染色 1 小时。基质检测组合含有 CD3 APC-eF780、CD19 NovaFluor Red 710、CD56 PE-Cy5、CD14 BUV395 和 CD20 Super Bright 780，用于描绘单核细胞、NK 细胞、T 细胞和 B 细胞亚群的轮廓。在存在 5 µL Invitrogen Super Bright 完全染色缓冲液（货号 SB-4401-42）的情况下制备该基质混合物，以防任何非特异性结合。使用 UltraComp eBeads Plus 补偿微球（货号 01-3333-41）设置分解。

选择主层标记物

对于 CD3+ T 细胞分析，去除 B 细胞、单核细胞和 NK 标记物后，CD4 与 CD8 也可视为主层分析标记物。主层标记物应与 Bigfoot 染色指数光谱暗淡范围内的荧光基团配对，原因是荧光基团本就暗淡，或仪器在特定波长下的灵敏度降低。采用荧光扣除 (FMO) 对照来验证细胞群门的准确性，特别是考虑到大范围的渗漏误差可能在高水平多色组合中造成问题，并对细胞群分辨率产生影响。例如，CD4+ 调节性 T 细胞具有 CD127 低表达或阴性和 CD25+ 的细胞表面标记物表型。T 细胞记忆亚群还具有过渡表达模式，CD45RA 和 CD197 与亮度更高的荧光基团搭配效果更好，这些基团彼此之间光谱溢出不大。记忆细胞亚群为 CD45RA- 和 CD197+/-。初始 T 细胞为 CD454RA+ 和 CD197+。效应 T 细胞亚群为 CD45RA+ 和 CD197-。从记忆细胞亚群可进一步推断出辅助性 T 细胞亚群。

CD3+ T 细胞。使用 Ficoll 分离法分离健康的 PBMC。使用 Invitrogen CellBlox 封闭缓冲液（货号 B001T06F01）对细胞进行 15 分钟预封闭。每次检测取检测组合中的每种抗体 5 µL，在 4°C 下对细胞染色 1 小时。过渡标记物（如 CD197 PE-Dazzle 594、CD45RA Super Bright 436、CD25 PE 和 CD127 Super Bright 702）可为 Tregs 和记忆细胞亚群描绘第二层 CD3+ 细胞亚群的轮廓。抗体在存在 Invitrogen Super Bright 完全染色缓冲液（货号 SB-4401-42）的情况下对细胞进行染色。采用 FMO 作为门控。

检测组合建议

第一层	基本表型标记物，解析能/否清晰分辨细胞群
第二层	过渡标记物，亚群表型、活化、衰老、耗竭等
第三层	罕见且低丰度的标记物，光漂白或渗漏误差极为严重时的重要组合

	层级
BUV395	1
BUV496	1
BUV563	1
BUV615	3
BUV661	3
BUV737	1
BUV805	1
Super Bright 436	3
Pacific Blue	2
BV480	2
BV510	2
BV570	1
Super Bright 600	2
Super Bright 645	1
Super Bright 702	3
Super Bright 780	1
FITC	2
L/D Olive	L/D
PCP-eFluor 710	2
PE	3
PE-eFlour 610	3
PE-Cy5	1 或 2
PE-CY7	2
PE-Fire 810	1
APC	2
NovaFluor Red 700	2
APC-eFluor 780	1 或 2
L/D NIR780	L/D

光谱分解：细胞与补偿微球

Bigfoot 可能对用补偿微球制备的分解对照品不敏感（相较于细胞而言）。对于本实验，使用了 UltraComp Plus eBeads（货号 01-3333-42）作为分解对照品。请特别注意，需要保持默认的双洗设置，以尽可能减少分解对照品之间的任何残留。如果您的样本或荧光剂粘性较大，请增加洗涤时长。

辅助性 T 细胞亚群是记忆细胞亚群，其等在功能和表型上均不同。Th1 和 Th2 细胞分别对微生物和寄生虫感染具有重要作用，特征是表达 CD183、CD194 和 CD197。Th9 和 Th22 亚群在过敏和肠道稳态中具有重要作用，特征是表达 CD196 和 CCR10。Tfh 细胞（滤泡辅助细胞）在 B 细胞功能中发挥重要作用，特征是表达 CD185。Th17 亚群对于对抗细菌和真菌具有重要作用，特征是表达 CD194。然而，需要在细胞内检测细胞因子和转录因子，以明确功能表型。

T 细胞亚群活性

活化、衰老和增殖标记物也是过渡标记物的示例，此类标记物与具有独特光谱的明亮荧光基团搭配使用效果较好。在此 CD4+ 细胞图中，CD38+ 表达代表的是从未成熟（阳性）到成熟（阴性）的表达范围。当与 HLA-DR 绘图时，表现出 MHC II 类表达的细胞如果呈双阳性，则代表是活化的 T 细胞亚群。

CD4+ 辅助性 T 细胞亚群。 使用 Ficoll 分离法分离健康的 PBMC。使用 Invitrogen CellBlox 封闭缓冲液（货号 B001T06F01）对细胞进行 15 分钟预封闭。每次检测取检测组合中的每种抗体 5 µL，在 4°C 下对细胞染色 1 小时。进一步采用第二层标记物（如 CD196 PE-Cy7、CD185 Brilliant Violet™ 480 和 CD197 PE-Dazzle 594）对不同的 CD4+ 辅助性 T 细胞亚群进行表型鉴定。HLA-DR FITC 和 CD38 BUV661 描绘出活化 T 细胞的轮廓。抗体在存在 Super Bright 染色缓冲液的情况下对细胞进行染色。采用 FMO 作为门控。

影响灵敏度的原因？

激光器功率
最佳激光波长激发荧光基团的状况
空气激发方式还是石英杯激发方式
液流宽度/PSI
PMT 还是 APD
大量样本的注意事项
- 因活化或疾病等发出的自体荧光
- Fc 结合/单一结合
大量检测的注意事项
- 单色染料分子的亮度
- 荧光基团与抗体之比
- 抗体亲和力
- 抗体的非特异性结合

Bigfoot 光谱流式细胞分选仪：灵敏、准确地鉴别细胞群

每个荧光基团都具有一定的能量吸收能力，并具有能将该能量以光子的形式发射出去的效率。这就是荧光基团独特的亮度。但抗体可能有所不同，具体取决于偶联到抗体的 1 至 6 个荧光基团，且该抗体对生物靶标的亲和力可能有高有低。此外，仪器的许多机械功能均会影响灵敏度和细胞群分辨率。对于 Bigfoot，相关的机械功能包括空气激发样本流，以及使用 PMT （光电倍增管）与 APD （雪崩光电二极管）。因此，不同仪器、生物学应用或抗体（染料配体）之间的灵敏度和细胞群分辨率是不一样的。检测组合的组分需要在进行检测的仪器上进行验证。下图显示了 CD4 荧光基团偶联物在 7 激光 Bigfoot 上对冻存 PBMC 的比较染色指数值。各染色指数值只是细胞群分辨率的一个组成部分。最终，成功分辨的决定性因素是，在代表该疾病或实验样本活化状态的细胞上使用全套的抗体检测组合，在各种光谱重叠的情况下，此检测还能准确地表示渗漏误差、自体荧光以及其他可能会混淆分辨率的因素。

如上图所示，使用 5 µL 与荧光基团偶联的 CD4 抗体，在室温下对冻存 PBMC 染色 30 分钟以分辨细胞群。根据这些常见荧光基团的染色指数在 Bigfoot 仪器中的7 激光配置上的表现计算得出。这种排序仅与单色染色对照品相关，无法描述这些荧光基团可能导致增加的渗漏误差的程度。

作为免疫功能衡量指标的检查点标记物

PD-1 在免疫调节中起着重要作用。正如其名称所示，程序性细胞死亡蛋白 1 作为细胞凋亡的调节因子，负责维持免疫平衡并抵抗自体免疫。对于抗原特异性 T 细胞，它可以促进细胞凋亡，而在调节性 T 细胞中，它可以抑制细胞凋亡。PD-1 是一种具有治疗指示意义的重要免疫检查点蛋白。在未活化的正常细胞中，PD-1 对 CD4 和 CD8 T 细胞的表达水平较低，因此很难分辨。分辨率问题可能会因为光谱溢出的渗漏误差而变得复杂。我们建议使用光谱溢出较少的明亮荧光基团，如 BUV 661 或 BUV615。

PD-1 表达。 使用 Ficoll 分离法分离健康的 PBMC。使用 Invitrogen CellBlox 封闭缓冲液（货号 B001T06F01）对细胞进行 15 分钟预封闭。每次检测取检测组合中的每种抗体 5 µL，在 4°C 下对细胞染色 1 小时。CD38 BUV661 和 PD-1 BUV615 是第三层表达标记物，在 Tregs、CD4+ 和 CD8+ T 细胞上具有不同程度的表达。抗体在存在 Invitrogen Super Bright 完全染色缓冲液（货号 SB-4401-42）的情况下对细胞进行染色。采用 FMO 作为门控。

B 细胞亚群活性

B 细胞亚群具有极其丰富的生物多样性。即使是基本 B 细胞表型的常用标记物 CD20，也并非总是在 B 细胞谱系中的某些亚群上表达，例如前 B 细胞和原 B 细胞或浆细胞。B 细胞的基本亚群标记物为 CD19、CD20、CD27、CD38、IgD、IgM、CD10 和 HLA-DR。在这些标记物组合中，可以根据成熟度、过渡状态、活化情况和类别转换进行轮廓描绘。可能需要特别注意的是 IgD 与 CD27/CD38（初始/成熟）以及 IgM（经过了类别转换）的关系。各亚群在 B 细胞的生命周期中均具有重要作用。

B 细胞。使用 Ficoll 分离法分离健康的 PBMC。使用 Invitrogen CellBlox 封闭缓冲液（货号 B001T06F01）对细胞进行 15 分钟预封闭。每次检测取检测组合中的每种抗体 5 µL，在 4°C 下对细胞染色 1 小时。B 细胞亚群的常见表型标记物为 HLA-DR FITC、IgD Super Bright 600、CD27 APC 和 IgM Brilliant Violet™ 510。抗体在存在 Invitrogen Super Bright 完全染色缓冲液（货号 SB-4401-42）的情况下对细胞进行染色。采用 FMO 作为门控。

对于非 B 细胞和非 T 细胞群，可以用 CD15 来排除任何污染的粒细胞，用 CD56 来分离出 NK 细胞，以进一步纯化。NK 细胞具有用 CD16 表达来定义的功能亚群。非 B 细胞、非 T 细胞和非粒细胞群可由 HLA-DR（一种在如单核细胞的抗原呈递细胞上表达的 MHC II 类标记物）进一步纯化。单核细胞的经典与非经典亚群可通过 CD14 和 CD16 表达模式来定义。

NK 细胞和单核细胞。 使用 Ficoll 分离法分离健康的 PBMC。使用 Invitrogen CellBlox 封闭缓冲液（货号 B001T06F01）对细胞进行 15 分钟预封闭。每次检测取检测组合中的每种抗体 5 µL，在 4°C 下对细胞染色 1 小时。使用 CD15 APC-Fire 810 从分析物中排除任何污染的粒细胞。CD56 PE-Cy5 NK 细胞可通过 CD56 高表达与低表达以及 CD16 BUV496 阳性细胞进行分群。HLA-DR FITC 可定义抗原呈递细胞，后者可通过 CD16 BUV496 和 CD14 BUV395 的过渡表达进一步分为经典、非经典和中间单核细胞。抗体在存在 Invitrogen Super Bright 完全染色缓冲液（货号 SB-4401-42）的情况下对细胞染色，并使用 FMO 作为门控。

光谱分解确认

最后，为确保数据质量，我们可采取的最关键步骤，就是确认分解的准确性。可通过多种方式实现此步骤。可以对照检测中使用的每种其他荧光剂的通道，在双变量图中对每种分解对照品作图。这是较为准确的方法。作为快速检查手段，还可以在 NxN 阵列中显示完全染色样本，以便识别任何重大异常。一般而言，您需要确定这些细胞群沿横轴和纵轴与负象限对齐。某些细胞群可以用共线方式表示，这会导致细胞群在双正象限呈现出类似彗星的样子，但更有可能的是细胞群按轴线排列。

NxN 中的 B 细胞标记物。用 NxN 阵列显示完全染色的样本是确认分解准确性的快速方法。在分析时将 NxN 显示划分成针对一个细胞亚群的标记物是很有帮助的。此外，通过对检测物中的每个其他荧光基团与单色分解对照品作图，来目视检查细胞群是否如预期排列，以确认分解的准确性。

8峰微珠分辨率

在 Bigfoot 光谱流式细胞分选仪上的关键通道中运行的 Spherotech™ 8峰微珠呈现出轮廓分明的窄峰。

关键通道中的8峰微珠分辨率。

使用诸如上面的调节 T 门等选通分选区域，对六个细胞群进行了分选：CD8⁺ 和细胞毒性 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、单核细胞和调节 T。为了进行分选后验证，重新分析了每个收集管的纯度。对分选细胞群的分析（图中显示了其中四个）表明，Bigfoot 光谱流式细胞分选仪的混合光谱分解能力产生结果的效率高且纯度超过 98%。这种分选性能相当于采样传统补偿的分选仪，从而可以让用户随着实验复杂性的增加在两种方法之间无缝过渡。

收集管的重新分析。

分选后，重新分析了收集管的纯度，证明存在界限清晰的以下细胞群：(A) CD8 T 细胞 (CD8^strong)、(B) 单核细胞 (CD14⁺)、(C) B 细胞 (CD19⁺CD20⁺) 以及 (D) 细胞毒性 T 细胞 (CD8^dimCD56⁺)。

利用光散射进行血细胞分化

虽然偏振是流式细胞术中常被忽略的一种激光特性，但它在区分某些细胞类型时很有用。例如，人类血液中的嗜酸性粒细胞由于其双折射特性，在侧散射 SSC 检测器中显示出相对较高水平的去极化激光。极化分析也已证明有助于疟疾诊断和海洋浮游植物研究。

Bigfoot 细胞分选仪的所有型号都包括用于去偏振光检测的附加 FSC（前散射）和 SSC 检测器。该图显示了使用 SSC 去极化检测器鉴定裂解人全血中的嗜酸性粒细胞。这种分化不需要染色，因而可使细胞不受干扰，并节省了荧光基团的费用。通过添加 CD16 染色剂，也可以鉴定其他细胞群。

使用光散射和 CD16 分析血液细胞群。

采集了裂解正常人全血，并在 Bigfoot 光谱流式细胞分选仪上进行了分析。(A) SSC x SSC 极性散点图显示的嗜酸性粒细胞具有较高的去极化 SSC，以红色突出显示。(B) FSC x SSC 等高线图显示的嗜酸性粒细胞因体积大于其他细胞而具有强 FSC 和 SSC 信号。(C) 未染色样本显示 BV510 通道中嗜酸性粒细胞的自体荧光。(D) CD16 BV510 染色细胞的散点图显示 CD16 阴性嗜酸性粒细胞，并根据 CD16 表达突出显示其他细胞群。

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不得转售。Super Bright 聚合物染料依据 Becton, Dickinson and Company 的许可销售。
仅供科研使用。不可用于诊断程序。