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Gateway 重组克隆技术
Invitrogen Gateway 重组克隆通过一个小时的可逆重组反应，无需使用限制酶、连接酶、亚克隆步骤或大量菌落筛选，从而节省了您的时间、成本和精力。优势包括：
- 95%的克隆效率
- 在整个克隆过程中保持方向和阅读框
- 可高效地将单个片段同时克隆到多个载体中
- 将多个基因片段克隆到单个构建体中的灵活性
- 可选择使用包含Gateway att 位点的 Invitrogen TOPO 克隆载体进入 Gateway 平台
- MultiSite Gateway 等技术的新进展使 Gateway 克隆成为蛋白表达和功能分析的理想克隆方法。
Gateway 重组克隆简化了分子克隆实验流程
典型的分子克隆实验流程（例如传统的限制性内切酶克隆）涉及许多步骤，可能会限制您的克隆成功率。例如，某些限制性酶可能无法使用，因为它们可能会切入您感兴趣的基因内，截短插入片段，使该基因无法用于下游表达。由于从克隆大片段中回收重组体效率低下，并且需要浪费时间来筛选菌落以寻找所需克隆，因此还需要其他清理步骤。所有这些步骤都需要花费大量的时间和精力，并且不能保证成功。相反，Gateway 重组克隆技术避免了这些克隆限制，使您几乎可以克隆进任何表达系统。
Gateway 重组克隆技术—“与发明者面对面”视频系列
表 1—Gateway 重组克隆与传统限制酶克隆的比较。
| 步骤 | Gateway 重组克隆 | 采用限制性酶进行亚克隆 |
|---|---|---|
| 已知引物？ | 是 | 否 |
| 载体准备就绪进行克隆？ | 是 | 否 |
| 包含连接试剂吗？ | 是 | 否 |
| 感受态细胞是单独的吗？ | 已包含 | 单独购买：0 小时 制备：高达 6 小时 |
| 载体纯化？ | 否 | 是 |
| PCR 片段纯化？ | 否 | 是 |
| 重组效率 | 高达 95% | ~50% |
| 进入表达载体的克隆时间* | 65 分钟 | 高达 24 小时 |
| *不包括两种方法共有的最短准备时间 | ||
基本克隆实验流程：获得更高效率的三个步骤
1.确定入门克隆
入门克隆 是您进行实验的方式和地点，因为它包含你的目的基因或 attL 序列插入的 DNA 片段，然后将其与 attR 序列重组以创建所需的表达克隆。选择一种我们的TOPO 克隆载体来构建您的入门克隆，或从经过验证的 Ultimate ORF 克隆库中购买预制克隆。
2.用Clonase酶介导反应
一旦准备好入门克隆，就可以将目标基因轻松地导入第二个质粒，即目标载体。该反应由 LR Clonase 酶混合物介导，利用蛋白机制从入门克隆中切除目的基因，整合至目标载体中，然后用作您的表达克隆。其逆反应很简单：利用 BP Clonase 酶混合物进行 BP 反应（attB 和 atPP 位点之间的重组）。LR Clonase和 BP Clonase 酶混合物均采用易于使用的预混液形式，确保了反应之间的一致性和可靠性。
3.选择目标载体
将目的基因或 DNA 片段克隆到 Gateway 载体后，您可以根据需要将其导入多个目标载体中（图 1）。
从大肠杆菌、酵母、昆虫或哺乳动物细胞中的蛋白表达到 RNAi 研究，从晶体学到蛋白与蛋白互作的功能研究，总有一种目标载体适合您的应用。对于需要特殊或定制载体的应用领域，Gateway 载体转换系统可以将任何载体转换为与 Gateway 克隆兼容的载体。
图 1.Gateway 技术有助于通过位点特异性重组将基因克隆到多个载体中或从中克隆出来。将基因克隆到入门克隆后，您可以同时将 DNA 片段移入一个或多个目标载体中。