Gateway克隆技术实验流程

步骤 1—生成 PCR 产物
使用 Taq 聚合酶和你自己的实验流程生成 PCR 产物。以最后 7 到 30 分钟的延伸步骤结束 PCR 反应。

步骤 2—完成TOPO 克隆反应    

1. 按所示顺序使用相关试剂配制以下 Invitrogen TOPO 克隆反应体系。对于电穿孔法，将盐溶液稀释 4 倍以制备稀释盐溶液。
   

   试剂	化学反应	电穿孔
   新鲜的 PCR 产物	0.5 至 4 µL	0.5 至 4 µL
   盐溶液	1 µL	—
   稀释盐溶液	—	1 µL
   无菌水	至最终体积 5 µL	至最终体积 5 µL
   TOPO 载体	1 µL	1 µL
   总体积：	6 µL	6 µL

2. 轻轻混匀并室温孵育 5 分钟。
3. 置于冰上，继续进行下面的 Invitrogen One Shot 化学感受态细胞的转化步骤

步骤 3—转化 One Shot 化学感受态细胞

1. 每次进行转化实验时，在冰上先解冻一小瓶 One Shot 大肠杆菌感受态细胞。
2. 将 2 µl TOPO 克隆反应液加到一小瓶 One Shot 化学感受态细胞中，并轻轻混合。
3. 在冰上孵育 5-30 分钟。
4. 42°C 热激细胞 30 秒，请勿震荡。立即将反应管转移至冰上。
5. 加入 250 µl 室温 S.O.C.培养基。
6. 于 37°C 振荡孵育 1 小时。
7. 在预热的含有 100 µg/ml 壮观霉素的 LB 琼脂平板上涂布 10–50 µl 细菌培养物，并在 37°C 下孵育过夜。

BP 反应

从含有attB 插入的 PCR 产物构建一个 Gateway 入口克隆是一个很简单的反应，仅需 1 小时。请参阅下面的设置概述。有关更多信息，请参阅手册。

1. 在室温下将以下成分添加到 1.5 ml 反应管中并混合：
    attB-PCR 产物（=10 ng/µl；最终量 ~15–150 ng）1–7 µl
   供体载体（150 ng/µl）1 µl
   TE 缓冲液，pH 8.0 至 8 µl
2. 冰上融化 Invitrogen BP Clonase II 酶混合物约 2 分钟。将 BP Clonase II 酶短暂涡旋两次（每次 2 秒）。
3. 向每个样品（上述步骤 1）中加入 2 µl BP Clonase II 酶混合物，并通过短暂涡旋两次使其充分混合。简短地进行离心。
4. 将 BP Clonase II 酶混合物储存至 –20°C 或 –80°C。
5. 25°C 下孵育 1 小时。
6. 向每个样品中加入 1 µl 蛋白酶 K 溶液以终止反应。短暂涡旋。在 37°C 下孵育 10 分钟。
   

转化

1. 将1 µl的每个 BP 反应物转化进 50 µl Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1 噬菌体抗性感受态细胞（货号 C8540-03）。冰上孵育 30 分钟。通过在 42°C 孵育 30 秒来热激细胞。加入 250 µl S.O.C.培养基，于 37°C 下振荡孵育 1 小时。分别将 20 µl 和 100 µl 的每次转化产物接种到选择性平板上。备注：可以使用任何转化效率 > 1.0×10 8 个转化子/μg 的感受态细胞。
2. 将 1 µl 的 pUC19 DNA（10 ng/ml）反应转化进上述50 µl Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1 噬菌体抗性感受态细胞中。在含有 100 µg/ml 卡那霉素或供体载体适当选择标记物的 LB 板上分别接种 20 µl 和 100 µl。

 
预期结果
如果将整个 BP 反应转化并铺板，则有效的 BP 重组反应将产生 > 1500 个菌落。 

LR 反应

将您的基因从 Gateway 入门克隆转移到目标载体的过程是一个很简单的反应，仅需 1 个小时。请参阅下面的设置概述。有关更多信息，请参阅手册。

1. 在室温下将以下成分添加到 1.5 ml 试管中并混合：
   入门克隆（50–150 ng）1–7 µl
   目标载体（150 ng/µl）1 µl
   TE 缓冲液，pH 8.0 至 8 µl
2. 冰上融化 Invitrogen LR Clonase II 酶混合物约 2 分钟。将 LR Clonase II 酶混合物短暂涡旋两次（每次 2 秒）。
3. 向每个样品（上述步骤 1）中加入 2 µl LR Clonase II 酶混合物，并通过短暂涡旋两次使其充分混合。简短地进行离心。
4. 将 LR Clonase II 酶混合物储存至 –20°C 或 –80°C 。
5. 25°C 下孵育 1 小时。
6. 向每个样品中加入 1 µl 蛋白酶 K 溶液以终止反应。短暂涡旋。在 37°C 条件下孵育 10 分钟。
   

转化
遵循 BP 反应实验流程，在LB 平板上使用针对目标载体的合适选择标记物（通常为100μg/ml 氨苄青霉素）。

预期结果
如果将整个 LR 反应转化并铺板，则有效的 LR 重组反应将产生 > 5000 个菌落。 

单管反应

如果您想将含 attB 的 PCR 产物直接转移到表达克隆中，则可以使用以下实验流程轻松地将 BP 和 LR 反应合并。这将有可能省去 Gateway 入门克隆的转化和 DNA 分离。

1. 在 1.5 ml 微量离心管中，准备以下 15 µl BP 反应：
   attB DNA（50-100 ng）1.0–5.0 µl
   attP DNA（Invitrogen pDONR 载体，150 ng/µl）1.3 µl
   BP Clonase II 酶混合物3.0 µl
   TE 缓冲液，pH 8.0 的最终体积为15 µl
2. 短暂涡旋混合均匀，然后在 25°C 下孵育 4 小时。
   备注：根据您的需要，重组反应的时间可以延长到 20 小时。过夜孵育所产生的菌落通常比 1 小时孵育结果多出 5 倍。对于大型质粒（=10 kb）和 PCR 产物（=5 kb），建议更长的孵育时间。
3. 将 5 µl 反应液移至另一个试管中，并使用该反应液评估 BP 反应的效率（请参见下文）。
4. 在剩余的 10 µl 反应中，添加：
   目标载体（150 ng/µl）2.0 µl
   LR Clonase II 酶混合物 3.0 µl
   最终体积 15 µl
5. 短暂涡旋混合均匀，然后在 25°C 下孵育 2 小时。
   备注：根据您的需要，重组反应的时间可以延长到 18 小时。
6. 加入 2 µl 蛋白酶 K 溶液。在 37°C 下孵育 10 分钟。
7. 用 1 µl 反应液转化 50 µl 合适的感受态细胞。
8. 在含有合适抗生素的 LB 平板上进行平板培养以选择表达克隆。
   

评估 BP 反应效率

1. 在从“单管”实验流程的上述步骤 3 中获得的 5 µl 反应液中，加入 0.5 µl 蛋白酶 K 溶液。在 37°C 下孵育 10 分钟。
2. 用 1 µl 反应液转化 50 µl 合适的感受态细胞。在含有合适抗生素的 LB 平板上进行平板培养以选择入门克隆。

Gatewa克隆载体转化

将您最喜欢的克隆载体系列转换为 Gateway 克隆技术是一个相当简单的过程，最终将使您简化克隆和表达过程。

若要将克隆载体转化成 Gateway 目标载体，过程如下：

1. 根据需要选择合适的阅读框。
2. 使用合适的限制酶线性化您希望转化的载体。如果使用会产生粘性末端的限制酶，则需要补平这些粘性末端。
3. 使用小牛肠道碱性磷酸酶从载体中去除 5’ 磷酸。
4. 使用 T4 DNA 连接酶将阅读框连接到载体中。
5. 将连接反应转化进 One Shot ccdB Survival 感受态细胞，然后选择转化子。
6. 分析转化子。