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提供检测化学方法 | 获得结果的时间(从细胞裂解到生成 qPCR 结果) | 工作范围 | 基因表达灵敏度 | |
---|---|---|---|---|
Cells-to-CT两步法试剂盒 | SYBR Green* 和 TaqMan** 形式 | 2 小时 | 10-100,000 个细胞 | 中至高等水平定量 |
Cells-to-CT一步法试剂盒 | SYBR Green* 和 TaqMan** 形式 | 35-85 分钟 | 10-100,000 个细胞 | 中等水平定量 |
Fast Advanced Cells-to-CT 两步法试剂盒 | SYBR Green* 和 TaqMan** 形式 | 80-95 分钟 | 10-100,000 个细胞 | 中至高等水平定量 |
Express Cells-to-CT 两步法 | 只有 TaqMan** 形式 | 70-85 分钟 | 10-100,000 个细胞 | 中至高等水平定量 |
CellsDirect 试剂盒 | 只有 TaqMan** 形式 | 40-60 分钟 | 1-10,000 个细胞 | 高等水平定量 |
Single Cell-to-CT试剂盒 | 只有 TaqMan** 形式 | 3小时 | 1-10 个细胞 | 高等水平定量 |
使用 Express 技术,Cells-to-CT 已经变得更加简单,只需一步即可完成细胞裂解,无需添加终止液。在该工作流程中,使用 Express 裂解液裂解 10–100,000 个培养细胞(贴壁细胞或悬浮细胞)。在 Express 裂解液中可选择添加 Invitrogen ezDNAse,以便在细胞裂解过程中去除基因组 DNA。在室温下孵育 5 分钟后,裂解物可直接使用 Invitrogen SuperScript IV VILO 进行反转录。反转录 (RT) 反应完成后,使用 TaqMan Fast Advanced 预混液和 TaqMan 基因表达检测试剂盒进行 qPCR 分析。
图 1.使用 TaqMan 阵列卡的 96 次检测数据,比较 TaqMan Cells-to-CT Express 试剂盒与使用纯化 RNA 的传统方法的性能。从 10,000 个 HeLa 细胞中获得的裂解物。
图 2.10-100,000 个 HeLa 细胞的裂解物样本显示,其 CT 值低于传统离心柱 RNA 纯化方法。使用细胞直接裂解法不会造成 RNA 的损失。
使用 Fast Advanced Cells-to-CT 试剂盒无需进行 RNA 纯化——使用反转录实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 直接从培养细胞样本中获得相对基因表达结果。该试剂盒采用独特的方法裂解培养细胞,同时去除基因组 DNA (gDNA) 并保持 RNA 的完整性,其包含反转录 (RT) 试剂用于 cDNA 合成,以及 TaqMan 或 SYBR Green 预混液用于实时荧光定量 PCR 分析。
Fast Advanced Cells-to-CT 两步法试剂盒较传统 RNA 纯化方法更快速、更方便,且不影响灵敏度(图 3)。由于工作流程以细胞裂解为基础,因此使用 Cells-to-CT试剂盒不会造成任何 RNA 损失。使用传统的 RNA 纯化方法时,由于过滤器或磁珠洗脱不充分,始终会损失少量的 RNA。因此,当使用Cells-to-CT试剂盒处理样本时,与使用 RNA 纯化流程处理相同样本的结果相比,在检测少量细胞样本 (10–1,000 个细胞)中稀有 RNA 的能力更加出色(图 4)。这一点,结合终止液的优点,使 Cells-to-CT工作流程比竞争对手试剂盒的灵敏度更高,可用于检测高丰度及低拷贝数的转录本。
图 3.TaqMan Fast Advanced Cells-to-CT 试剂盒与其他试剂盒的灵敏度比较。遵照各试剂盒的实验方案裂解 104 个细胞。在每种试剂盒的反转录试剂 (RT) 中加入最高量的裂解液(Cells-to CT 和 Fast Advanced Cells-to CT 试剂盒为45%;其他供应商的产品为 10%)。然后将 25% 的 转录试剂 (RT) 加入磷酸二酯酶 TaqMan Array 的 qPCR 反应中,使用各试剂盒中的 qPCR 预混液。Fast Advanced Cells-to CT试剂盒较早期的 Cells-to-CT 试剂盒平均低 0.5 Ct,较其他供应商的试剂盒低 3.6 Ct(灵敏度较其他供应商的试剂盒高 11 倍)。
图 4.检测比较。遵照各试剂盒的实验方案裂解 104 个 HepG2 细胞。在每种试剂盒的反转录试剂 (RT) 中加入最高量的裂解液(Cells-to CT 和 Fast Advanced Cells-to CT 试剂盒为45%;其他供应商的产品为 10%)。然后在其他供应商试剂盒的 qPCR 反应中加入 25% 的反转录试剂 (RT);在 Fast Advanced Cells-to CT 试剂盒的 qPCR 反应中加入 30%,在 Power SYBR 试剂盒中加入 45%。分析 10 种不同的基因。大多数基因在该细胞系中未检测到。在检测到的基因中,对于大多数基因,Fast Advanced Cells-to CT 试剂盒的 Ct值低于其他试剂盒。
CellsDirect qPCR 试剂盒可直接从细胞获得高灵敏度、高特异性的实时 qPCR 结果,无需进行 RNA 纯化步骤,每次反应只需不到 10,000 个细胞,最少只需要一个细胞。CellsDirect 技术使用少量的样本实现最高的灵敏度(图 5)。
图 5.CellsDirect qPCR 试剂盒最少可对一个细胞样本进行高灵敏度检测。根据 CellsDirect 实验方案裂解并重悬 HeLa 细胞。10倍连续稀释细胞裂解液,从 10,000 个细胞到 1 个细胞。在 ABI PRISM 7700 仪器上,使用 TaqMan 探针和含 ROX 的 CellsDirect 一步法 qPCR 试剂盒检测低丰度靶标 RRKCA。根据标准曲线 (未显示) 得出的效率为 97%,R² =0.998。
CellsDirect 一步法 qPCR 试剂盒集高灵敏度、出色的便捷性和高通量等优势为一体。使用 CellsDirect 一步法试剂盒,只需将细胞裂解物直接加入您的 qPCR 反应混合物中,将其放入实时定量仪器中,即可开始使用。这些试剂盒可用于 LCM 技术采集的样本的基因表达检测(图 6)。
图 6.CellsDirect 一步法 qPCR 试剂盒为 LCM 样品提供灵敏的结果。LCM 样本的 CellsDirect RNA 纯化表明,一步法试剂盒足够灵敏,可以获得样本量少于 100 个细胞的结果。
Cells-to-CT 试剂盒提供完整的工作流程,可以直接从培养细胞进行反转录实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 分析,无需 RNA 纯化。该试剂盒采用独特的方法裂解培养细胞,同时去除基因组 DNA (gDNA) 并保持 RNA 的完整性,其包含反转录 (RT) 试剂用于 cDNA 合成,以及 TaqMan 或 SYBR Green 预混液用于实时荧光定量 PCR 分析。
Cells-to-CT 试剂盒的所有组分都经过了优化,用于获得一致且稳定的实验结果。这样可以尽可能减少组装单独的样品制备和反转录实时荧光定量 PCR (RT-PCR) 预混液过程中可能出现的不确定性。
为了增加质量保证,Cells-to-CT 1-Step TaqMan 试剂盒已通过 TaqMan 基因表达试验验证,Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green 试剂盒已通过一组常见基因靶标引物验证。两者均表现出与纯化 RNA 相当的性能(图 7)。
图 7.Cells-to- T 试剂盒的灵敏度和有限靶序列的检测。(A) 使用裂解液和纯化的 RNA 进行基因表达检测的灵敏度对比。使用 Cells-to-CT 1-Step TaqMan 试剂盒处理 HeLa 细胞 (10–100,000 个细胞),或者使用 RNA 离心柱法纯化 RNA,重复进行三次。每组样本在 7900HT 实时荧光定量 PCR 系统上进行实时 RT-PCR 分析,检测 Cells-to-CT 对照试剂盒中的 XENO 和 ACTB。(B) 有限靶序列的检测。向 10,000 个 HeLa 细胞中加入越来越多的 NIH3T3 细胞(小鼠)。使用 TaqMan 基因表达 Cells-to-CT 试剂盒(两步法流程)或 RNA 离心柱法纯化试剂对细胞进行处理,重复进行三次。所有样本在 7900HT Fast 实时荧光定量 PCR 系统上进行小鼠特异性基因 (B2M) 和人类特异性基因 (TKT) 反转录,重复三次。
TaqMan Cells-to-CT 基因表达试剂盒与市售其他裂解试剂盒和纯化 RNA 的性能对比。每次裂解反应使用 100–100,000 个细胞进行检测。TaqMan Cells-to-CT 试剂盒方案的灵敏度与使用纯化 RNA 方案的灵敏度相当,并且超过了其他供应商的产品(图 8)。
使用 Express 技术,Cells-to-CT 已经变得更加简单,只需一步即可完成细胞裂解,无需添加终止液。在该工作流程中,使用 Express 裂解液裂解 10–100,000 个培养细胞(贴壁细胞或悬浮细胞)。在 Express 裂解液中可选择添加 Invitrogen ezDNAse,以便在细胞裂解过程中去除基因组 DNA。在室温下孵育 5 分钟后,裂解物可直接使用 Invitrogen SuperScript IV VILO 进行反转录。反转录 (RT) 反应完成后,使用 TaqMan Fast Advanced 预混液和 TaqMan 基因表达检测试剂盒进行 qPCR 分析。
图 1.使用 TaqMan 阵列卡的 96 次检测数据,比较 TaqMan Cells-to-CT Express 试剂盒与使用纯化 RNA 的传统方法的性能。从 10,000 个 HeLa 细胞中获得的裂解物。
图 2.10-100,000 个 HeLa 细胞的裂解物样本显示,其 CT 值低于传统离心柱 RNA 纯化方法。使用细胞直接裂解法不会造成 RNA 的损失。
使用 Fast Advanced Cells-to-CT 试剂盒无需进行 RNA 纯化——使用反转录实时荧光定量 PCR (RT-qPCR) 直接从培养细胞样本中获得相对基因表达结果。该试剂盒采用独特的方法裂解培养细胞,同时去除基因组 DNA (gDNA) 并保持 RNA 的完整性,其包含反转录 (RT) 试剂用于 cDNA 合成,以及 TaqMan 或 SYBR Green 预混液用于实时荧光定量 PCR 分析。
Fast Advanced Cells-to-CT 两步法试剂盒较传统 RNA 纯化方法更快速、更方便,且不影响灵敏度(图 3)。由于工作流程以细胞裂解为基础,因此使用 Cells-to-CT试剂盒不会造成任何 RNA 损失。使用传统的 RNA 纯化方法时,由于过滤器或磁珠洗脱不充分,始终会损失少量的 RNA。因此,当使用Cells-to-CT试剂盒处理样本时,与使用 RNA 纯化流程处理相同样本的结果相比,在检测少量细胞样本 (10–1,000 个细胞)中稀有 RNA 的能力更加出色(图 4)。这一点,结合终止液的优点,使 Cells-to-CT工作流程比竞争对手试剂盒的灵敏度更高,可用于检测高丰度及低拷贝数的转录本。
图 3.TaqMan Fast Advanced Cells-to-CT 试剂盒与其他试剂盒的灵敏度比较。遵照各试剂盒的实验方案裂解 104 个细胞。在每种试剂盒的反转录试剂 (RT) 中加入最高量的裂解液(Cells-to CT 和 Fast Advanced Cells-to CT 试剂盒为45%;其他供应商的产品为 10%)。然后将 25% 的 转录试剂 (RT) 加入磷酸二酯酶 TaqMan Array 的 qPCR 反应中,使用各试剂盒中的 qPCR 预混液。Fast Advanced Cells-to CT试剂盒较早期的 Cells-to-CT 试剂盒平均低 0.5 Ct,较其他供应商的试剂盒低 3.6 Ct(灵敏度较其他供应商的试剂盒高 11 倍)。
图 4.检测比较。遵照各试剂盒的实验方案裂解 104 个 HepG2 细胞。在每种试剂盒的反转录试剂 (RT) 中加入最高量的裂解液(Cells-to CT 和 Fast Advanced Cells-to CT 试剂盒为45%;其他供应商的产品为 10%)。然后在其他供应商试剂盒的 qPCR 反应中加入 25% 的反转录试剂 (RT);在 Fast Advanced Cells-to CT 试剂盒的 qPCR 反应中加入 30%,在 Power SYBR 试剂盒中加入 45%。分析 10 种不同的基因。大多数基因在该细胞系中未检测到。在检测到的基因中,对于大多数基因,Fast Advanced Cells-to CT 试剂盒的 Ct值低于其他试剂盒。
CellsDirect qPCR 试剂盒可直接从细胞获得高灵敏度、高特异性的实时 qPCR 结果,无需进行 RNA 纯化步骤,每次反应只需不到 10,000 个细胞,最少只需要一个细胞。CellsDirect 技术使用少量的样本实现最高的灵敏度(图 5)。
图 5.CellsDirect qPCR 试剂盒最少可对一个细胞样本进行高灵敏度检测。根据 CellsDirect 实验方案裂解并重悬 HeLa 细胞。10倍连续稀释细胞裂解液,从 10,000 个细胞到 1 个细胞。在 ABI PRISM 7700 仪器上,使用 TaqMan 探针和含 ROX 的 CellsDirect 一步法 qPCR 试剂盒检测低丰度靶标 RRKCA。根据标准曲线 (未显示) 得出的效率为 97%,R² =0.998。
CellsDirect 一步法 qPCR 试剂盒集高灵敏度、出色的便捷性和高通量等优势为一体。使用 CellsDirect 一步法试剂盒,只需将细胞裂解物直接加入您的 qPCR 反应混合物中,将其放入实时定量仪器中,即可开始使用。这些试剂盒可用于 LCM 技术采集的样本的基因表达检测(图 6)。
图 6.CellsDirect 一步法 qPCR 试剂盒为 LCM 样品提供灵敏的结果。LCM 样本的 CellsDirect RNA 纯化表明,一步法试剂盒足够灵敏,可以获得样本量少于 100 个细胞的结果。
Cells-to-CT 试剂盒提供完整的工作流程,可以直接从培养细胞进行反转录实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 分析,无需 RNA 纯化。该试剂盒采用独特的方法裂解培养细胞,同时去除基因组 DNA (gDNA) 并保持 RNA 的完整性,其包含反转录 (RT) 试剂用于 cDNA 合成,以及 TaqMan 或 SYBR Green 预混液用于实时荧光定量 PCR 分析。
Cells-to-CT 试剂盒的所有组分都经过了优化,用于获得一致且稳定的实验结果。这样可以尽可能减少组装单独的样品制备和反转录实时荧光定量 PCR (RT-PCR) 预混液过程中可能出现的不确定性。
为了增加质量保证,Cells-to-CT 1-Step TaqMan 试剂盒已通过 TaqMan 基因表达试验验证,Cells-to-CT 1-Step Power SYBR Green 试剂盒已通过一组常见基因靶标引物验证。两者均表现出与纯化 RNA 相当的性能(图 7)。
图 7.Cells-to- T 试剂盒的灵敏度和有限靶序列的检测。(A) 使用裂解液和纯化的 RNA 进行基因表达检测的灵敏度对比。使用 Cells-to-CT 1-Step TaqMan 试剂盒处理 HeLa 细胞 (10–100,000 个细胞),或者使用 RNA 离心柱法纯化 RNA,重复进行三次。每组样本在 7900HT 实时荧光定量 PCR 系统上进行实时 RT-PCR 分析,检测 Cells-to-CT 对照试剂盒中的 XENO 和 ACTB。(B) 有限靶序列的检测。向 10,000 个 HeLa 细胞中加入越来越多的 NIH3T3 细胞(小鼠)。使用 TaqMan 基因表达 Cells-to-CT 试剂盒(两步法流程)或 RNA 离心柱法纯化试剂对细胞进行处理,重复进行三次。所有样本在 7900HT Fast 实时荧光定量 PCR 系统上进行小鼠特异性基因 (B2M) 和人类特异性基因 (TKT) 反转录,重复三次。
TaqMan Cells-to-CT 基因表达试剂盒与市售其他裂解试剂盒和纯化 RNA 的性能对比。每次裂解反应使用 100–100,000 个细胞进行检测。TaqMan Cells-to-CT 试剂盒方案的灵敏度与使用纯化 RNA 方案的灵敏度相当,并且超过了其他供应商的产品(图 8)。
单细胞分析在候选药物筛选、细胞分化和干细胞研究以及检测单个细胞对特定刺激的反应等应用中至关重要。由于组织由异质细胞混合物组成,因此基于均质群体的基因表达检测不能解释单个细胞中发生的微小但关键的变化。
该试剂盒为基因表达分析提供了经验证的工作流程,并为单细胞研究提供了标准化平台。
群体中的单细胞精度
我们已经开发出功能强大的检测设计算法、经优化的预混液、直观的数据分析软件和灵活的仪器,有助于在丰富多样的应用中发挥 qPCR 的强大作用。
如需了解更多信息,请访问:thermofisher.com/quantstudioqpcrfamily
了解如何使用培养细胞制备用于基因表达分析的 RNA,而无需进行 RNA 纯化。仅需 7 分钟即可快速实现 RT-qPCR。
在 Cells-to-CT 方案中,先用 PBS 清洗细胞,然后吸出 PBS。
在 Cells-to-CT 方案中,将裂解液加入到含有细胞的孔中,上下吹打混匀,在室温下放置 5 分钟。
在 Cells-to-CT 方案中,将终止液加入在裂解液中的细胞,在室温下等待两分钟。
观看在 Cells-to-CT 方案中 RT 预混液的制备过程。
本次 ASCB 演讲的内容为 Cells-to-CT 试剂盒如何帮助您利用 qPCR 测量相对基因表达,无需在扩增前纯化 RNA。
了解如何在 7 分钟内使用培养细胞制备用于基因表达分析的 RNA。
使用 Cells-to-CT 试剂盒,您可以在更短的时间内获得实时荧光定量 PCR 结果。他们快速、简单且功能强大。更少处理步骤有助于确保缩短实验时间,提高一致性,将样本损失降至最低,以及减少污染风险。
Cells-to-CT 试剂盒提供完整的工作流程,可以直接使用培养细胞进行反转录实时荧光定量 PCR (qRT-PCR) 分析,无需 RNA 纯化。反转录和 qPCR 在一个孔中进行。该试剂盒使用反转录 (RT) 试剂进行 cDNA 合成,并提供基于染料(SYBR Green 染料)或基于探针(TaqMan 探针)的预混液用于实时荧光定量 PCR 分析。
一步法和两步法试剂的区别在于,一步法试剂盒将反转录和实时荧光定量 PCR 融到一个步骤中,缩短了实验所需的整体时间。
根据以下 10 个样本的实验,Cells-to-CT 试剂盒在 7 分钟内产生 6g 塑料废弃物和 0 mL 有害废弃物,相比而言,采用 RNEasy 进行标准 RNA 纯化,则会产生 140 g 塑料废弃物和 18 mL 有害废弃物。
RNeasy 35分钟 140 g 塑料废弃物 18 mL 有害废弃物 | Cells-to-CT 7 分钟 6.6 g 塑料废弃物 0 mL 有害废弃物 |
可以。Cells to CT 试剂盒与多重 qPCR 检测试剂盒兼容。如果要检测多个靶标,我们建议使用 TaqMan 形式。
Cells-to-CT 技术采用独特的方法裂解培养细胞,同时去除基因组 DNA (gDNA) 并保持 RNA 的完整性。因此,通过按照方案中的裂解/DNase 处理步骤,qPCR 反应过程中将不会出现 gDNA 污染问题。
是的,这款试剂盒可以制备充足的材料用于基因芯片分析。预扩增后的样本体积为 26.5 µL,1:20 稀释后的总体积为 530 µL,这足以用于大量 TaqMan qPCR 检测、TLDA 卡或用在 QuantStudio OpenArray 中。
虽然我们还没有在内部尝试过,但有理由相信这种方法应该是可行的。然而, 可能需要围绕反转录 (RT) 步骤优化方案,因为 FFPE 样品具有许多可能会影响反转录酶效率的 RNA 交联。在添加 RT 之前将样品在 80°C 下加热 10 分钟,以获得良好的 cDNA 转化,这应该会改善反转录。
细胞系 | 生长类型 | 来源物种 | 来源组织 |
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A549 | 贴壁 | 智人 | 肺癌 |
BJ | 贴壁 | 智人 | 包皮 |
CHO-K1 | 贴壁 | 中国地鼠(仓鼠) | 卵巢 |
COS-7 | 贴壁 | 埃塞俄比亚绿猴(猴) | 肾脏 |
DU-145 | 贴壁 | 智人 | 前列腺 |
HEK-293 | 贴壁 | 智人 | 肾脏 |
HeLa | 贴壁 | 智人 | 宫颈腺癌 |
HepG2 | 贴壁 | 智人 | 肝癌 |
Huh-7 | 贴壁 | 智人 | 肝 |
Jurkat | 悬浮 | 智人 | 急性 T 细胞白血病 |
K562 | 悬浮 | 智人 | 骨髓 |
ME-180 | 贴壁 | 智人 | 宫颈表皮样癌 |
NCI-H460 | 贴壁 | 智人 | 肺 |
Neuro 2A | 贴壁 | 小家鼠 | 脑 |
NIH/3T3 | 贴壁 | 小家鼠(小鼠) | 胚胎成纤维细胞 |
PC-12 | 贴壁 | 褐家鼠(大鼠) | 肾上腺嗜铬细胞瘤 |
PT-K75 | 贴壁 | 野猪(猪) | 鼻甲粘膜 |
Raji | 悬浮 | 智人 | B 淋巴细胞 |
SK-N-AS | 贴壁 | 智人 | 脑神经母细胞 |
SK-N-SH | 贴壁 | 智人 | 脑成纤维细胞 |
U-2 OS | 贴壁 | 智人 | 骨骼 |
U-87 MG | 贴壁 | 智人 | 脑胶质母细胞瘤 |
注释:由于细胞大小和组成的差异,对于不同的细胞系,每次裂解反应的最大细胞数可能略有不同。通过使用 TaqMan Cells-to-CT 对照试剂盒对抑制效果和最小样本量进行测试。
仅供科研使用,不可用于诊断目的。