TaqMan 与 SYBR 试剂的实时荧光定量 PCR

背景

最初，使用嵌入式染料进行实时荧光PCR产物定量。但这些染料存在重大缺点，即会同时检测特异性以及非特异性 PCR 产物的扩增量。

TaqMan 方法的开发

通过引入基于Taq DNA 聚合酶 5’ 核酸酶活性的荧光标记探针，实时定量 PCR 系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用，使得实时定量的方法得到了发展，实现了仅对特定扩增产物的检测。

逐步过程

两种类型的 TaqMan 探针

我们可提供两种类型的 Applied Biosystems™ TaqMan® 探针：

• TaqMan 探针（含有 TAMRA™ 染料——淬灭基团染料）
• TaqMan® MGB 探针

推荐用于等位基因检测的 TaqMan MGB 探针

我们一般推荐使用 TaqMan MGB 探针进行等位基因分型分析，特别是当传统 TaqMan探针超过30个核苷酸时。TaqMan MGB 探针包含：

• 位于 3’ 端的非荧光淬灭基团——由于淬灭基团不发出荧光，因此实时荧光定量 PCR 仪器可以更精确地检测出报告基团染料
• 位于 3’ 端的小沟结合物——小沟结合物可提高探针的熔解温度 (Tm)，缩短探针的长度。

最终，TaqMan MGB 探针会在匹配和未匹配探针之间展现出更大的 Tm 值差异，从而提供更准确的等位基因分型。

TaqMan 方法的优点

• 需要在探针和目标分子（靶点）之间发生特异性的水解（杂交），方可生成荧光信号
• 您可使用明显不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列
• 无需 PCR 后处理，减少分析工作量并节省材料成本

TaqMan 方法的缺点

主要缺点在于需要根据不同的序列，合成不同的探针。

背景

一般将可与双链DNA发生结合的小分子分为以下两类：

• 嵌入剂
• 小沟结合物

无论哪种结合方法，用于PCR实时检测的DNA结合染料都需要满足以下两个条件：

• 结合至双链DNA时，会有增强的荧光
• 对 PCR 不会产生抑制

我们开发更加优化的条件，使得 SYBR Green I 染料的使用对 PCR 产生轻微抑制并带来相对于溴化乙锭更为灵敏的检测。另外，我们还有更新的 SYBR Green 染料，可发出更亮的荧光，并且与初代 SYBR Green I 相比，对 PCR 的抑制更少。

SYBR 染料试剂工作原理

SYBR 染料通过与 PCR 过程中形成的双链 DNA 结合来检测聚合物链反应 (PCR) 产物。工作原理：

逐步过程

1. 当 SYBR 染料加入到样品中后，它可立即与样品中的所有双链 DNA 进行结合 。
2. 在 PCR 过程中，DNA 聚合酶对产生 PCR 产物的目标序列进行扩增。
3. 随后，SYBR 染料会与每一个新产生的双链 DNA 分子进行结合。
4. 随着 PCR 进行，生成更多 PCR 产物。SYBR® 染料可与所有的双链 DNA 结合，因此荧光强度也会随着 PCR 产物的增加而增加。

SYBR 染料的优点

• 它可用于监测任何双链 DNA 序列的扩增。
• 无需探针，可降低检测设置和运行成本，假定您的 PCR 引物经过精心设计并且反应的表征良好。

SYBR 染料的缺点

最大缺点在于可能会产生假阳性信号；即，因为 SYBR 染料可与任何的双链 DNA 发生结合，因此也会与非特异性的双链 DNA 序列发生结合。因此，使用经过精心设计的引物极其重要，这样不会扩增非目标序列，并执行熔解曲线分析。

其他注意事项

采用 DNA 结合染料的另一原因，是多种染料分子可能与单一扩增 DNA 分子结合。基于多重染料的结合，将迎来信号量取决于在反应中所产生的双链DNA量的局面。因此，如果扩增效率相同，相较于对较短产物的扩增，对较长产物的扩增将会产生更多的信号。这完全不同于荧光探针，使用荧光探针时，对于每个合成的扩增分子淬灭仅释放一个荧光基团，与其长短并不相关。