实时荧光定量PCR原理及基础知识

实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）指的是在PCR进行的同时，对其过程进行监测的能力（即实时）。因此，数据可在PCR扩增过程中，而非PCR结束之后，进行收集。这为基于PCR的DNA和RNA定量方法带来了革命性的变革。在实时荧光定量PCR (qPCR)中，反应以循环中首次检测到目标扩增的时间点为特征，而非在一定循环数后目标分子累计的扩增量。目标核酸的起始拷贝数越高，则会越快观察到荧光的显著增加。相反，终点法检测（也称 “读板检测”）测量的是PCR循环结束时累计的PCR产物量。

我们开发了两种通过使用序列检测系统（SDS）仪器进行PCR产物检测的试剂：

• Applied Biosystems TaqMan 试剂（也称“荧光5’核酸酶试剂”）
• Applied Biosystems SYBR Green I染料试剂

TaqMan方法

TaqMan方法通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。

使用TaqMan方法的检测类型

TaqMan方法可用于以下检测类型：
定量，包括：

• 用于RNA定量的一步法RT-PCR
• 用于RNA定量的两步法RT-PCR
• DNA/cDNA定量
  • 等位基因检测
  • 通过IPC进行的正负检测

 SYBR Green I染料试剂

SYBR Green I染料法采用了Applied Biosystems SYBR Green I染料，一种可以在PCR循环过程中随着PCR产物的累计而对其进行检测的高度特异性双链DNA结合染料。TaqMan和SYBR Green I染料法最为重要的区别在于SYBR Green I染料试剂可以检测所有双链DNA，包括非特异性的反应产物。因此这样经过特别优化的反应体系，对于获取准确的结果而言是非常必要的。

使用SYBR Green I染料法的检测类型

SYBR Green I染料法可用于以下检测类型：

• 用于RNA定量的一步法RT-PCR
• 用于RNA定量的两步法RT-PCR
• DNA/cDNA定量

TaqMan试剂

最初，使用嵌入式染料进行实时荧光PCR (qPCR) 产物定量。但这些染料存在重大缺点，即会同时检测特异性以及非特异性PCR产物的扩增量。

TaqMan方法的开发

通过引入基于Taq DNA聚合酶5’核酸酶活性的荧光标记探针，实时定量PCR系统得到了显著提升。这些荧光探针的使用，使得实时定量的方法得到了发展，实现了仅对特定扩增产物的检测。此外，荧光标记探针的开发，也免去了用于探针降解分析的PCR反应后处理过程。

TaqMan序列检测方法的工作原理

TaqMan试剂通过采用荧光探针在PCR循环过程中随着特定PCR产物的累计而对其进行检测。工作原理：

步骤、过程

1. 构建一段寡核苷酸探针：5’端标记荧光染料报告基团，3’端标记淬灭染料基团。当探针保持完整时，淬灭基团的靠近会通过空间上的荧光共振能力转移（FRET）而显著降低由报告染料基团发射的荧光。
2. 如果存在目标序列，探针便会在其中一个引物结合位点的下游发生退火，并随着引物的延伸通过Taq DNA聚合酶的5’核酸酶活性，完成切除。
3. 探针的切除将会引起：
   • 将报告染料基团和淬灭染料基团进行分离，增强了报告染料基团的信号。
   • 将探针从目的链上去除，使引物继续沿模板链末端延伸。因此，探针的介入并不会抑制整个PCR过程。
4. 每经过一个循环，就会有更多的报告基因染料分子从各自的探针上切断，荧光强度会随着合成的扩增片段数量的增加而增加。

两种类型的 TaqMan 探针

我们可提供两种类型的Applied Biosystems TaqMan 探针：

• TaqMan探针（含有Invitrogen TAMRA染料——淬灭染料基团）
• Applied Biosystems TaqMan MGB探针

推荐用于等位基因检测的 TaqMan MGB 探针

我们一般推荐使用TaqMan MGB探针进行等位基因分型分析，特别是当传统TaqMan探针超过30个核苷酸时。TaqMan MGB探针包含：

• 位于3’ 端的非荧光淬灭基团——由于淬灭基团不发出荧光，因此SDS仪可以更精确地检测出报告基因染料 。
• 位于3’ 端的小沟结合物 – 小沟结合物可提高探针的熔解温度（Tm），缩短探针的长度。

最终，TaqMan MGB 探针会在匹配和未匹配探针之间展现出更大的 Tm 值差异，从而提供更准确的等位基因分型。

TaqMan 方法的优点

• 需要在探针和目标分子（靶点）之间发生特异性的水解（杂交），方可生成荧光信号
• 您可使用明显不同的报告基因染料标记探针，在一个反应管内扩增并检测两个不同的序列
• 无需PCR后处理，减少分析工作量并节省材料成本。

TaqMan方法的缺点：

TaqMan方法的主要缺点在于需要根据不同的序列，合成不同的探针。

一般将可与双链DNA发生结合的小分子分为以下两类：

• 嵌入剂
• 小沟结合物

无论哪种结合方法，用于PCR实时检测的DNA结合染料都需要满足以下两个条件：

• 结合至双链DNA时，会有增强的荧光
• 对 PCR 不会产生抑制

我们开发更加优化的条件，使得SYBR Green I染料的使用不会对PCR产生抑制并带来相对于溴化乙锭更为灵敏的检测。

SYBR Green I染料法的工作原理

SYBR Green I染料法通过SYBR Green I染料与PCR过程中产生的双链DNA结合，而对聚合酶链反应（PCR）的产物进行检测。工作原理：

步骤、过程

当SYBR Green I染料被加入到样品中后，它可立即与样品中的双链DNA进行结合 。

1. 在PCR过程中，Applied Biosystems AmpliTaq Gold DNA聚合酶可对目标序列进行扩增，以产生PCR产物，即“扩增子”。
2. 随后，SYBR Green I染料会与每一个新产生的双链DNA分子进行结合。
3. 随着PCR的进行，越来越多的扩增子被生成。由于SYBR Green I染料可与所有的双链DNA结合，因此荧光强度也会随着PCR产物的增加而增加。

SYBR Green I染料法的优点

• 它可用于监测任何双链 DNA 序列的扩增。
• 无需探针，降低了检测的设置和运行成本。

SYBR Green I染料法的缺点：

SYBR Green I染料法的最大缺点在于可能会产生假阳性信号；即，因为SYBR Green I染料可与任何的双链DNA发生结合，因此也会与非特异性的双链DNA序列发生结合。

其他注意事项

采用DNA结合染料的另一原因，是多重染料与单一扩增分子的结合。这可提高扩增产物检测的灵敏度。基于多重染料的结合，将迎来信号量取决于在反应中所产生的双链DNA量的局面。因此，如果扩增效率相同，相较于对较短产物的扩增，对较长产物的扩增将会产生更多的信号。这完全不同于荧光探针，使用荧光探针时，对于每个合成的扩增分子淬灭仅释放一个荧光基团，与其长短并不相关。

什么是定量检测？

定量检测是一种实时的PCR (qPCR) 检测。测量（定量）每轮PCR扩增循环中，检测目标核酸片段的量。目标分子可以为DNA、cDNA或RNA。此方法指南主要对以下三种定量检测进行讨论：

• DNA/cDNA定量
• 采用一步法逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的RNA定量
• 采用两步法RT-PCR的RNA定量

定量分析常见术语

扩增子：PCR过程而产生的DNA短片段
扩增曲线：根据荧光信号相对于循环数而制作的曲线
基线：PCR起始时，荧光信号还未发生变化的几个循环
Ct（阈值循环）：荧光信号超过NTC（无模板对照样品）固定阈值时的循环数 。用于对扩增质量进行验证。
核酸目标：（也称为“目标模板”）——需要扩增的DNA或RNA序列
惰性参比染料： 一种可作为内部对照，以用于在数据分析时对报告基团染料信号进行均一化的染料。均一化是对因浓度或体积变化而随之引起波动进行的必要校正。所有的SDS PCR试剂盒都提供了参比荧光对照。
Rn（均一化报告基团）：报告基团染料释放的荧光强度除以惰性参比染料释放的荧光强度
Rn+: 一次反应的Rn值包含所有的组分，包括模板
Rn-：未反应样品的Rn值。Rn值可通过以下方式获取：

• 实时荧光定量PCR (qPCR) 运行的早期循环（产生可被检测的荧光信号之前的循环），或
• 不含有任何模板的反应

ΔRn (delta Rn): 在特定PCR条件设置下所产生的信号量级。
ΔRn可通过以下公式计算：(Rn+) – (Rn-)标准品 具有已知浓度的A样本，用于绘制标准曲线。通过使用不同浓度的标准品，您可构建用于未知样品定量分析的标准曲线。
阈值：早期PCR循环时Rn值的平均标准差，乘以相应的校正系数阈值应当设定在PCR指数扩增时的相关区域。
未知：具有未知模板量的样品。即，您需要进行检测的样品。

实时PCR (qPCR) 定量检测工作原理

在PCR的起始循环中，荧光信号几乎不发生变化。从而定义为扩增曲线中的基线。而超出基线部分的荧光的增加，则为对累计目标分子的检测。固定的荧光阈值线，可设置在基线之上。荧光超过固定阈值时的循环数则为参数CT（阈值循环）。

当对定量检测的结果进行计算时，可以采用绝对或相对定量。

什么是绝对定量？

绝对定量检测是根据标准曲线对未知样品进行的定量。

示例

绝对定量可根据病毒的拷贝数，监控疾病状态。研究者须知道特定生物学样品中目标RNA分子的准确拷贝数，以对疾病的进展进行监测。绝对定量可通过从所有SDS仪器获取的数据进行，但注意标准品的绝对定量则须首先通过其他方法获取。

什么是相对定量？

相对定量用于分析特定样品相对于参照样品（比如，未处理的对照组）某个基因表达量的变化。

示例

相对定量可用于检测化合物（药物）引起的基因表达改变。经化学处理样品中的特定目标基因的表达水平可与相对未处理样品中的基因表达水平进行比较。

相对定量的计算方法

相对定量可根据从所有SDS仪器获取的数据而进行。用于相对定量的计算方法有：

• 标准曲线法
• 比较CT法

确定使用哪种方法 所有方法都可产生同等的结果。当在确定使用哪种方法时，需要注意：

• 在不同的反应管中进行目标分子和内源性对照的扩增时，采用标准曲线法进行分析，所需优化和验证操作最少。
• 采用比较CT法时，则须进行验证实验，以表明目标分子和内源性对照扩增的效率基本相同。比较CT法的优势在于无需标准曲线，从而可以实现通量提高（因为无需额外的孔用于标准曲线的绘制）；并消除在进行标准曲线绘制时因稀释错误所带来的不利结果。
• 如需将靶标和内源性对照品在同一管内进行扩增，则须优化并限制引物的浓度以避免对 CT 值产生影响。当在一管中进行双重反应时，可以提高通量并减少移液失误所带来的不利影响。

常用术语

绝对和相对定量中常用的术语，如下：

• 标准：用于构建标准曲线的已知浓度样品。
• 参考文献：用于对实验结果进行均一化的阴性或阳性信号。内源性和外源性对照是常见的阳性对照
• 阳性对照指的是因 PCR扩增 而产生的信号。阳性对照则具有自己的引物和探针组合。
• 内源性对照：指的是，在每个样品进行提取时便已存在于样品中的RNA或DNA。当采用内源性对照作为阳性对照时，您可通过对信使RNA（mRNA）的均一化定量来消除每次反应中加入的总RNA量的差异。
• 外源性对照：指的是，在每个样品中加入的具有已知浓度的特殊RNA或DNA。外源性阳性对照通常是来自可以作为内部阳性对照（IPC）的体外成分，可区分真正的目标阴性和PCR抑制。此外，外源性对照还可均一化样品提取或逆转录中互补DNA（cDNA）合成的效率差异。无论是否使用阳性对照，使用含有ROX染料的参比荧光对照都是十分重要的，因为它可以对非PCR相关的荧光信号波动进行均一化。
• 目标分子的均一化量：一个可以用于比较不同样品中目标分子相对量的无单位数字。
• 校准品：可以用作比较结果基础的样品。

概述

因采用的是相对于基础样品的表达量，例如校准品，用于相对定量的标准曲线一般都比较容易绘制。对于所有的实验样品，其目标分子的量均是从标准曲线获取，然后除以校准品的目标分子量而确定的。因此，校准品便成为1 X 样品，而所有其他的量则都为以n倍校准品来表示。例如，在研究药物对表达产生的影响时，未处理的对照样品便是合理恰当的校准品。

关键指南

以下指南可为相对定量中标准曲线的正确使用，提供关键指导：

• RNA或DNA储存液的准确稀释是十分重要的，但用于表达稀释的单位是无关的。如果对来自对照细胞系的总RNA进行了2倍的稀释后进行标准曲线的绘制，则单位应该是稀释值1、0.5、0.25、0.125等。如果使用相同的 RNA 或 DNA 储存液进行不同板上的标准曲线绘制，则可在不同板之间比较确定的相对定量。
• 也可使用DNA标准曲线进行RNA的相对定量。这么做需要假设目标分子在所有样品中的逆转录效率都是相同的，但并不需要知道效率的绝对值。
• 在采用内源性对照进行定量均一化时，应该对目标分子和内源性对照都进行标准曲线的绘制。对于每一个实验样品，目标分子和内源性对照的量都是根据合适的标准曲线而确定的。因此，目标分子的量除以内源性对照的量便是均一化后的目标分子值。同样的，其中的一个实验样品便是校准品，或1×样品。每一个均一化的目标分子值除以校准品的均一化值后便是相对的表达水平。

内源性对照

对于内源性对照进行扩增可用于对加入至反应的样品RNA或DNA的量进行标准化。对于基因表达定量，研究者采用过 ß-肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）、核糖体RNA（rRNA）或其他RNA作为内源性对照。

标准品

由于样品量会除以校准品的量，则标准曲线中的单位便被去除了。因此，对于标准品来说所有需要知道的只是它们的相对稀释比。对于相对定量，任何含有合适目标分子的RNA或DNA储存液都可用作标准品。

比较CT法与标准曲线法相似，只是它利用的是算术公式2−^ΔΔC_T来获取相同的相对定量结果。

算术公式：

为了有效地利用比较 CT 法，目标分子（基因）和对照（内源性对照）的扩增效率应当近似相同。
更多关于使用比较CT法进行相对定量的信息，请参阅用户手册#2：基因表达的相对定量（PN4303859）。

概述

用于绝对定量的标准曲线法与用于相对定量的标准曲线法类似，只是标准品的绝对量必须首先通过其他独立方法获取。

关键指南

下面的指南对于绝对定量中标准曲线的正确使用十分关键：

• 来自单一、纯净物种的DNA或RNA是十分重要的。例如，从大肠杆菌制备的质粒DNA通常都会存在RNA的污染，这会增加A260的读数而增加质粒的拷贝数计算结果。
• 准确的移液是必需的因为标准品需要经过不同的数量级的顺序稀释。质粒DNA或体外转录的RNA必须被浓缩以便获取准确的A260测量值。浓缩的DNA或RNA随后必须被稀释106–1012倍以获得与生物学样品中目标分子相似的浓度。
• 稀释的标准品的稳定性也需要引起注意，特别是对于 RNA。将稀释的标准品分装至多份，储存在-80°C，并仅在使用前才进行解冻。

 无法使用DNA作为RNA绝对定量的标准品，因为对于逆转录过程的效率没有对照。

标准品

标准品的绝对量必须首先通过其他独立的方法获取。质粒 DNA 和体外转录的 RNA 通常用于制备绝对标准品。浓度可在A₂₆₀ 处被测量得到，并通过使用DNA或RNA的分子量转化成拷贝数。

PCR过程以及5’核酸酶处理受到Roche Molecular Systems, Inc.以及F. Hoffmann-La Roche Ltd.所拥有的专利保护。 

所有其他 商标归其各自所有者所有。