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TaqMan 检测试剂盒如何工作？
Applied Biosystems™ TaqMan® 实时荧光定量 PCR 检测试剂盒包括靶标特异性引物和一个或多个探针，已针对特定测量类型进行优化。不同类型检测试剂盒的作用机制如下文所述。
TaqMan® 基因表达检测试剂盒基于 5' 核酸酶检测法，该方法使用荧光探针检测 PCR 过程中积聚的特异性 PCR 产物。
每个检测试剂盒包含：
- 一对未标记的引物
- 一条 TaqMan 探针，5’ 端标记 FAM™ 或 VIC™ 染料，3’ 端标记小沟结合物 (MGB) 和非荧光淬灭基团 (NFQ)
下图描述 TaqMan 基因表达检测流程。
- 在开始实时荧光定量 PCR 的时候，升高温度使双链 cDNA 变性。在此步骤过程中，TaqMan 探针 5’ 端上的荧光染料发出的信号被 3’ 端上的 NFQ 淬灭。
- 在下一步骤中，降低反应温度，使引物和探针退火到特定靶标序列。
- Taq DNA 聚合酶使用未标记的引物和模板合成新链。当聚合酶达到 TaqMan 探针时，其内源性 5’ 核酸酶活性裂解探针，使染料与淬灭基团分离。
每个 PCR 循环都会释放更多染料分子，导致与合成的扩增子数量成比例的荧光强度增加。
TaqMan MGB 探针包含一个小沟结合部分，可增大匹配和不匹配探针之间的 Tm 差异。此外，TaqMan MGB 探针还包含一个非荧光淬灭基团，在一个反应中使用多种染料时可增强光谱分辨率。
查询 TaqMan 第13集——TaqMan 工作原理
TaqMan 基因分型检测试剂盒（TaqMan® SNP 基因分型检测试剂盒和 TaqMan® 药物代谢基因分型检测试剂盒）包括预先优化的 PCR 引物对和两条探针，可用于等位基因分型。
每个检测试剂盒包含：
- 一对未标记的引物
- 位于 5’ 端的两条 TaqMan 探针（一条标记 FAM 染料，一条标记 VIC 染料）以及位于 3´ 端的小沟结合物 (MGB) 和非荧光淬灭基团 (NFQ)。
TaqMan 基因分型检测试剂盒用于扩增和检测基因组 DNA (gDNA) 内的特异性等位基因。下图描述 TaqMan SNP 基因分型检测流程。
- 将基因组 DNA 引入包含 TaqMan® 基因分型预混液、正向和反向引物以及两条 TaqMan® MGB 探针的反应混合物中。
- 每条 TaqMan MGB 探针专门退火到正向和反向引物位点之间的互补序列（如果存在）。当探针完整时，淬灭基团染料靠近报告基团染料会抑制报告基团荧光。
- AmpliTaq Gold® DNA 聚合酶的核酸外切酶活性仅裂解杂交到靶点的探针。裂解可分离报告基团染料与淬灭基团染料，增加报告基团产生的荧光。只有扩增目标序列与探针互补时，荧光才会增加。因此，PCR 扩增产生的荧光信号表明样品中有哪些等位基因。
在双重实时荧光定量聚合酶链式反应 (PCR) 中，TaqMan® 拷贝数检测试剂盒与 TaqMan® 拷贝数参考检测试剂盒一起运行。拷贝数检测试剂盒检测靶标基因或感兴趣的基因组序列，而参考检测试剂盒检测已知存在于二倍体基因组的两个拷贝中的一个序列。
在 PCR 过程中：
a. 一个 TaqMan® 拷贝数检测试剂盒、一个 TaqMan® 拷贝数参考试剂盒、TaqMan® 基因分型预混液和一个 gDNA 样品混合在单孔或单管中。
b. gDNA 模板已变性，并且每组检测试剂盒引物退火到特定目标序列。每支 TaqMan® 探针专门退火到正向和反向引物结合位点之间的互补序列。当每条寡核苷酸探针完整时，淬灭基团染料靠近报告基团染料会导致报告基团染料信号被淬灭。
c. 在每轮 PCR 过程中，AmpliTaq® Gold DNA 聚合酶同时对靶标和参考序列进行扩增。此酶具有 5′ 核酸酶活性，可裂解杂交到每个扩增子序列的探针。当寡核苷酸探针被 AmpliTaq Gold DNA 聚合酶 5′ 核酸酶活性裂解时，淬灭基团与报告基团染料分离，可增加报告基团的荧光。通过监测每个报告基团染料的荧光在每个 PCR 循环期间的增加程度，可实时检测 PCR 产物的积聚。
此相对定量法用于测定 gDNA 样品中感兴趣靶点的相对拷贝数（归一化到参考序列的已知拷贝数）。
查询 TaqMan 第34集 拷贝数变异——它如何工作？
使用 TaqMan® Advanced miRNA 检测试剂盒进行定量分析要求执行 cDNA 合成步骤，之后使用实时荧光定量 PCR 进行检测。
TaqMan Advanced miRNA 检测试剂盒工作流程。
(A) cDNA 合成工作流程包括 3´ 多聚腺苷酸添加和 5´ 适配体连接步骤，之后使用通用型 RT 引物进行逆转录。然后选择执行 miR-Amp 反应，以在通过 qPCR 进行检测之前均匀增多 miRNA cDNA。
(B) 每个 TaqMan Advanced miRNA 检测试剂盒采用 TaqMan 小沟结合物 (MGB) 探针，该探针专门退火到正向和反向引物位点之间的互补序列。MGB 修饰提高了熔解温度，而未增加探针长度，可设计更短的探针。当探针完整时，报告基团染料靠近非荧光淬灭基团 (NFQ) 会导致报告基团荧光受抑制。在引物延伸过程中通过 DNA 聚合酶进行探针裂解，可分离报告基团染料与 NFQ，导致报告基团荧光增多。
查询 TaqMan 第31集 查找最合适的 MicroRNA 检测试剂盒
TaqMan® 突变检测试剂盒基于新型极具竞争力的等位基因特异性 TaqMan (castPCR™) 技术，将等位基因特异性 TaqMan qPCR 与等位基因特异性 MGB 阻滞剂寡核苷酸结合在一起，可以有效抑制非靶标等位基因的非特异性扩增。
突变等位基因检测试剂盒或野生型等位基因检测试剂盒包括一个等位基因特异性引物（红色）、位点特异性引物（紫色）、位点特异性 TaqMan 探针（绿色）和等位基因特异性阻滞剂（蓝色）。样品的突变水平可基于突变等位基因检测试剂盒和相应的野生型等位基因检测试剂盒，或者突变等位基因检测试剂盒和基因参考检测试剂盒的 ΔCt 计算得出。
TaqMan® 蛋白检测试剂盒是邻位连接技术 (PLA™) 的新形式，它将抗体-蛋白质结合与通过实时荧光定量 PCR 检测报告基团核酸结合在一起。
TaqMan 蛋白检测工作流程
| 在非离子型洗涤剂缓冲液中使用温和的一步法程序溶解样品（细胞或组织），无需进一步的样品净化或纯化步骤。 |
|---|---|
结合 | 检测探针是通过生物素-链霉素亲和素链接与寡核苷酸偶联在一起的靶标特异性抗体。探针对中的每个寡核苷酸代表 5′ 或 3′ 端；当检测探针上的抗体与靶蛋白上的两个不同的抗原决定簇相结合时，它们相互邻接。 |
连接/失活 | 连接酶的底物是第三寡核苷酸杂交到检测探针对的寡核苷酸端而形成的桥接结构。当检测探针通过与靶蛋白结合而相互邻接时，会优先形成此结构。 |
TaqMan 快速实时荧光定量 PCR | 连接产物可作为 DNA 模板，使用 TaqMan 蛋白质检测试剂盒进行实时荧光定量 PCR。其作用机制与基因表达检测相同，使用未标记引物和 TaqMan 探针，5´ 端带有荧光标记，3´ 端标记非荧光淬灭基团 (NFQ)。 |
数据分析 | 使用免费的 ProteinAssist™ 软件包分析 TaqMan 蛋白质检测数据。 |
仅供科研使用，不可用于诊断目的。