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Pro-Detect快速检测
尽管目前已有多种方法可用于对目标蛋白的存在与否进行鉴定，但通常都需要较高的工作量、时间和成本。Thermo Scientific Pro-Detect 快速检测试剂盒以及Pro-Detect 快速竞争法检测试剂盒可通过检测表达的标签蛋白来确定蛋白的表达及纯化方法是否成功。这些侧向流试纸条形式的检测试剂盒为实时监测蛋白表达及纯化的所有阶段提供了一种简单而省时的方法。仅需将样品稀释并将试纸条插入样品中，便可在10-15分钟内获得可视化的定性结果。
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产品优势
- 快速简便—无需特殊仪器，可在10-15分钟内获得可视化的定性结果
- 灵敏—可在细胞培养基、裂解液或纯化蛋白中对低至 ng/ml 水平的蛋白或抗体进行检测
- 兼容性强—耐受常见浓度的去垢剂和盐离子
- 可靠—结果与标准的蛋白定量检测方法相当，如免疫印迹及ELISA
- 特异—不会与其他靶标发生交叉反应
- 经济—无需其他不必要的下游分析，从而节省成本
应用
- 鉴定蛋白表达是否在未诱导时发生
- 通过确定诱导剂的最佳浓度及最佳诱导时间进行蛋白表达条件优化
- 对含有目标蛋白的洗脱组分进行快速鉴定
性能数据
图 1. Pro-Detect快速检测试剂盒是一款基于夹心法侧向流动的检测试剂盒。 特异性针对待测物的金偶联捕获抗体被插入至试纸条底部的偶联衬垫中。 此外，特异性针对待测物的检测抗体被插入至检测线位置，而对照抗体被插入至试纸条顶端的对照线位置（A）。 在使用时，可与任何存在的待测物结合的捕获抗体可穿过整个膜并在检测及对照线位置发生溶解，呈现出红色的条带(B)。 如果没有呈现出检测条带，则表明样品是阴性的(B)，而当检测线和对照线都有条带时才能表明样品中存在待测物 (C)。
图 2. Pro-Detect 竞争法 检测试剂盒是一款竞争性侧向流动检测试剂盒。 目标待测物以三条不同的检测线形式被固定在膜上。 对照抗体被固定作为对照线。 特异性针对待测物的金偶联捕获抗体被插入至偶联衬垫中（A）(A)。 在样品中不存在待测物或浓度低于检测下限的阴性结果中，金偶联的捕获抗体将会与插入至检测线中的待测物进行结合并形成3条可见的红线(B)。 在样品中含有待测物的阳性检测中，插入至偶联衬垫中的金偶联抗体将会与样品中存在的待测物结合，因而不会与固定在检测线中的待测物将结合。 因此，检测线将不会呈现为红线并在检测线处形成竞争结合。 样品中待测物的浓度与试纸条上呈现的检测线数量成负相关(C)。 无论是阳性还是阴性检测，金偶联捕获抗体都会在对照线与对照抗体相结合。
| 检测类型 | 靶标 | 检测的理想范围* | 注 |
|---|---|---|---|
| 夹心法检测 | DYKDDDK-His | 0.1-10 µg/mL | 侧向流动检测试剂盒可以对范围之外的浓度进行检测；然而，工作浓度范围之外的条带强度将会偏低。 不推荐用于浓度低于0.01 μg/mL的样品。 |
| SUMO | |||
| GST | |||
| MBP | |||
| Human Fc | |||
| Rabbit Fc | |||
| Mouse Fc | |||
| 竞争法检测 | His | 4-20 µg/mL | 竞争性侧向流动检测可检测低至1 μg /mL的样品，但较弱的条带可能会为区分带来困难。 由于并不存在上限，侧向流动试纸条在浓度高于20μg/mL时会继续呈现阳性结果，即检测线的完全消失（距离样品较近的检测线会先消失）。 不推荐用于浓度低于1 μg/mL的样品。 |
| DYKDDDK | |||
| HA | |||
| Strep | |||
| AVI | |||
| Myc | |||
| V5 |
* 适当的样品稀释对于获取理想结果是必要的。 浓度范围是基于样品中目标标签蛋白的浓度而定的。
我们对 Pro-Detect快速检测试剂盒在多种浓度的蛋白表达及分离应用中存在常用去污剂及盐离子时的性能进行了检测。 下表总结了每种检测产品对于相关去污剂及盐离子的耐受水平的预估。
所列举的浓度指的是蛋白样品中实际的浓度。 Pro-Detect 快速检测试纸条经0 µg/mL (阴性对照)或0.1 µg/ml 的阳性对照检测用于夹心法分析，或10µg/mL的阳性对照检测用于竞争法分析。 所有的添加剂均被加入至PBS中。 不会干扰检测结果的严格条件限制已被列入表格中。。
| 检测类型 | 靶标 | Nacl | 尿素 | TX 100 | SDS | NP40 | EDTA | 甘油 | KCl | CHAPs | RIPA | BPER | MPER |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 夹心法检测 | DYKDDDDK – His（双标签） | 1.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 7.5mM | 10% | 1.5M | 1% | 90% | 90% | 90% |
| SUMO | 1.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 7.5mM | 10% | 1.5M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| GST | 1.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 7.5mM | 10% | 1.5M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| MBP | 1.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 7.5mM | 10% | 1.5M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| 人 Fc | 1.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 7.5mM | 10% | 1.5M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| Rabbit Fc | 1.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 7.5mM | 10% | 1.5M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| 小鼠 Fc | 1.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 7.5mM | 10% | 1.5M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| 竞争法检测 | His | 0.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 5mM | 10% | 0.5M | 1% | 90% | 90% | 90% |
| DYKDDDDK | 0.25M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 5mM | 10% | 0.25M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| HA | 0.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 5mM | 10% | 0.5M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| Strep II | 0.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 5mM | 10% | 0.5M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| AVI | 0.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 5mM | 10% | 0.5M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| Myc | 0.25M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 7.5mM | 10% | 0.25M | 1% | 90% | 90% | 90% | |
| V5 | 1.5M | 0.4M | 1% | 0.20% | 1% | 7.5mM | 10% | 1.5M | 1% | 90% | 90% | 90% |
图 3. Pro-Detect 快速 GST检测试纸条与相应的粗裂解液和纯化蛋白之间无交叉反应活性。 如图所示，Pro-Detect 快速 GST检测试纸条与其他哺乳动物、细菌以及 sf9细胞（泳道1-5）的内源性蛋白或任何其他非特异性标签蛋白（泳道7-19）之间不存在交叉反应活性。 此外，即便使用加入了10% FBS的100% 最低必需培养基，仍然未检测到交叉反应活性。 CHO 及 Hela 细胞裂解液通过采用氮空化方法在含有 10 mM Hepes、150 mM KCL 以及 1 mM Mg(OAc)2的缓冲液中进行制备。 HEK 293 裂解液使用 Pierce IP 裂解缓冲液（货 号87787）进行制备并在 1mg/ml 浓度下进行检测。 BL21裂解液使用B-PER细菌蛋白提取试剂（货 号90084）按照操作说明进行制备，并采用Pro-Detect稀释缓冲液进行4倍稀释至约185 µg/ml的终浓度。 纯蛋白如GST、MBP、SUMO以及Fc标签蛋白使用0.1 µg/ml浓度而其余更小的标签蛋白（泳道13-19）使用10 µg/ml浓度。 必要时，所有的稀释液均采用 Pro-Detect稀释缓冲液在96孔板中稀释至100 µl。 单独的Pro-Detect 快速 GST检测试纸条被放置进孔中达15分钟。 在检测线(T)位置出现红线时，可通过对试纸条进行扫描或拍照来保存结果。
免疫印迹是一种应用广泛、高认可度的从复杂混合物中特异性识别目的蛋白的工具。 但这一过程非常耗费时间和人力，需要大量的实验操作步骤和碎片化时间。 Pro-Detect 快速检测可快速提供精度与之相当的结果，但是处理时间更短(10-15分钟)，所需的手动操作步骤更少。
图 4. GST 蛋白检测： Pro-Detect 快速 GST 检测试剂盒与基于考马斯染料 R-250 b的蛋白染色方法及基于化学发光的免疫印迹检测比较。
左图： 在 4-12% SDS-PAGE 上分离指定浓度的纯化 GST 蛋白，然后采用 Imperial 染色剂（货 号 24615）染色1小时，之后再多次水洗脱色3小时。
中图： 在 4-12% SDS-PAGE 上分离指定浓度的纯化 GST 蛋白，然后使用Pierce Power Blotter转印设备（货号 22834）和1-Step 转印缓冲液（货 号84731）转印到硝酸纤维素膜（货 号88018）上。 该膜经Starting block T20（货号 37543）封闭后，用 GST 抗体（货号 MA4-004)孵育，之后用10 ng/mL的羊抗兔 IgG (H+L) HRP 二抗（货号 34265)孵育。 与SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物（货号 34580）一同孵育 5分钟后进行化学发光检测。 在iBright 成像系统（货号 A32752）上，在不同时间捕获信号。 以上所示是在 10秒 曝光时捕获的结果。
右图： 指定浓度的纯化 GST 蛋白使用 Pro-Detect 样品稀释液在 96 孔板上稀释至总体积为100µl。 将单独的 Pro-Detect 快速 GST 检测试纸条放入各孔中 15 分钟。在检测线(T)位置出现红线时，可通过对试纸条进行扫描或拍照来保存结果。 请注意，当蛋白浓度预计会超出检测线性范围的上限（通常为1µg/ml）时，由于所谓的钩状效应现象，会在检测线上出现假阴性结果。 此时建议将样品再稀释 10-100 倍，以便在线性范围内进行检测。
图 5. His His 标签蛋白检测 Pro-Detectt快速 DYKDDDDK 竞争法检测与基于考马斯染料 R-250的蛋白染色方法以及基于化学发光的免疫印迹检测的比较。
左图： 在 4-12% SDS-PAGE 上分离指定浓度的纯化 DYKDDDDK标签重组蛋白，然后使用 Imperial 染色剂（货 号 24615）染色1小时，之后再多次水洗脱色3小时。
中图： 在 4-12% SDS-PAGE 上分离指定浓度的纯化 DYKDDDDK 标签重组蛋白，然后使用Pierce Power Blotter转印设备（货号 22834）和1-Step 转印缓冲液（货 84731）转印到硝化纤维膜（货号 88018）上。 该膜采用Starting block T20（货号 37543）封闭，并与抗 DYKDDDDK 表位抗体（货号 PA1-984B)孵育，之后用山羊抗小鼠 IgG (H+L) HRP二抗（货号 31430）孵育。 与SuperSignal West Pico PLUS 化学发光底物（货号 34580）孵育 5分钟后进行化学发光检测。 在iBright 成像系统（货号 A32752）上，在不同时间捕获信号。 以上所示是在 2秒 曝光时捕获的结果。
右图： 指定浓度的纯化 DYKDDDDK 标签重组蛋白采用 ProDetect 样品稀释液在 96 孔板上稀释至总体积为 100µl。 将单独的 ProDetect 快速 His 竞争法检测试纸条放入各孔中 15 分钟。在检测线(T)位置出现红线时，表示存在 His 标签蛋白，可通过对试纸条进行扫描或拍照来保存结果。
Pro-Detect快检试纸订购信息
用于抗体分型的侧向流检测
Pro-Detect 快速抗体分型检测试剂盒是一种侧向流动检测试剂盒，对于免疫球蛋白的类别、亚类以及单克隆抗体的轻链可实现高灵敏度的快速鉴定。 可提供两种不同形式的快速分型试剂盒， 包括试纸条和卡夹形式。
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