Alexa Fluor標識ナノボディ

Alexa Fluor 568 conjugated anti-rabbit IgG, co-stained with Diamond DAPI for nucleus, and Phalloidin 488 for actin.

蛍光標識ナノ二次抗体

Invitrogen Alexa Fluorナノ二次抗体*は画期的な新しいクラスの蛍光標識抗体で、基礎研究者やトランスレーショナル研究者に機能と時間節約の面で利点を提供します。ナノ二次抗体は単鎖の単一ドメイン分子であるため従来の抗体とは構造的に異なり、免疫蛍光法や高分解能顕微鏡法などの顕微鏡アプリケーションですぐに使用できます。Invitrogen Alexa Fluorコンジュゲートナノ二次抗体を使用すると、ワークフローの負担軽減と交差反応の防止により科学的生産性を向上でき、さまざまなサンプルおよび細胞タイプで一次ターゲットを正確に特定できます。

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ナノ二次抗体とは？

ナノ二次抗体またはナノボディは、リャマやアルパカなどのラクダ科種で発見されました。ナノボディ分子は従来の抗体の重鎖ドメインの抗原結合領域を保持しますが、他の軽鎖可変領域を有しません（図1）。これらの単一ドメイン抗体の分子量は小さく（15 kDa）、研究および治療分野で広く使用されるようになりました。これは、後天性血栓性血小板減少性紫斑病（aTTP）の治療用に、最近カプラシズマブが臨床開発されたことで示されています（1、2）。その独自の構造により、二次抗体としての機能性が多くの点で向上しています。Invitrogen組換えナノ二次抗体は他の種のIgGとの交差反応が最小限で、一次抗体や他のナノ二次抗体と共インキュベーションできるため、マルチプレックスにおいて大幅な時間短縮を可能にします。最終的には、Invitrogenナノ二次抗体は蛍光顕微鏡法で実験的利点を提供します。

Alexa Fluorナノ二次コンジュゲート抗体の利点：

Alexa Fluorコンジュゲートナノ二次抗体を一次抗体と共インキュベーションして、ワークフローを50%削減（図2）
ウサギ、ラット、ヒツジ、ヤギ、モルモット、ヒト、およびサル血清の他のIgGとの交差反応なし
STEDやSTORM などの超高分解能顕微鏡での使用が検証済み
さまざまな細胞タイプおよびモデルで使用可能
組換えにより産生された抗体は、さまざまな厳しい化学的および物理的条件下でロット間の一貫性と安定性を提供

Recombinant Alexa Fluor conjugated nanobodies

図1.488、568、および647のオプションを利用できるAlexa Fluorナノ二次重鎖抗体の説明。従来のIgG抗体（左）は、定常領域（C_H、C_L）および可変領域（V_H、V_L）を有する重鎖および軽鎖領域で構成されます。重鎖の単一ドメイン可変領域がナノボディ分子（V_HH）を構成します。これらの単一ドメインナノボディ分子は組換え抗体として産生され、488、568、および647などのAlexa Fluor色素（右）にコンジュゲートされます。

組換えナノ二次抗体（V_HH）は、従来のIgG抗体の約1／10のサイズです。Alexa Fluorナノ二次抗体は親和性が高く、交差反応性が最小限であるため、生細胞モデルで一次抗体と共インキュベーションできます。そのため、複数のインキュベーションおよび洗浄ステップが不要になり、標準的なイメージングプロトコルを50%削減します（図2）。重要なのは、複雑なタンパク質構造内のアクセスが困難なエピトープに結合する際に、これらの抗体は空間的利点を有するため、細胞内のさらなる詳細を得られることです。図3は、より多くの二次分子が標的に結合することを可能にする空間的利点を示しており、これによりイメージングアプリケーションにおけるシグナルの輝度と分解能が向上します。以下の画像ギャラリーで、さまざまな免疫蛍光アプリケーションにおける蛍光検出をご覧ください。

Alexa Fluorナノ二次抗体により免疫細胞化学（ICC）ワークフローを50%削減

Nanobodies reduce the immunocytochemistry workflow by 50%

図2.ナノ二次抗体と従来の二次抗体を用いたICCワークフローの比較。Alexa Fluorコンジュゲートアルパカ組換えナノ二次抗体との同時インキュベーションは、ICCプロトコルにおける洗浄や別のインキュベーションを必要とせず、最終的にワークフローとサンプル処理時間を50%削減します。

Nanobodies conjugated to fluorescent molecules binding their primary target

図3.標的に結合する単一ドメインナノ二次結合と従来のIgG二次抗体のサイズ比較。Alexa Fluor 488アルパカ抗ウサギナノ二次抗体（SA510323）などの蛍光標識ナノ二次抗体（V_HH）は、IgG一次抗体のFabおよびFcの両領域に結合します（左）。同じターゲットに結合する従来の蛍光標識二次抗体（右）は、そのサイズのために、ナノ二次抗体と比較して結合できる二次抗体分子が少ないことを示しています。

Alexa Fluorコンジュゲートアルパカ組換えナノボディの画像ギャラリー

Fluorescent staining using Alexa Fluor 488 Nano secondary antibodies and imaging reagents.

図4.Alexa Fluor 488アルパカナノ二次抗体、DAPI、およびファロイジンによる多重免疫染色。HeLa細胞を0.1% BSA中で一次および二次抗体とともに室温で2時間同時にインキュベーションし、イメージング前にPBSTで4回洗浄しました。（A）マウスIgG1抗Ku80一次抗体（MA512933）をAF488アルパカ抗マウスIgG1ナノ二次抗体（SA510329）で標識しました。（B）は核をDAPIで染色して（青色）ProLong Diamondにマウントし、（C）はAlexa Fluor 594ファロイジン（A12381）を使用してF-アクチンを染色しました。（D）すべての染色のオーバーレイを示す複合画像。

Fluorescent staining using Alexa Fluor 568 Nano secondary antibodies and imaging reagents

図5.Alexa Fluor 568アルパカナノ二次抗体、DAPI、およびファロイジンによる多重免疫染色。HeLa細胞を0.1% BSA中で一次および二次抗体とともに室温で2時間同時にインキュベーションし、イメージング前にPBSTで4回洗浄しました。（A）ウサギIgG1抗Lamin B1一次抗体（PA579606）をAF568アルパカ抗マウスIgG1ナノ二次抗体（SA510331）で標識しました。（B）は核をDAPIで染色して（青色）ProLong Diamondにマウントし、（C）はAlexa Fluor 488ファロイジン（A12379）を使用してF-アクチンを染色しました。（D）すべての染色のオーバーレイを示す複合画像。

図6.HeLa細胞のワンステップ免疫染色（上段）と連続免疫染色（下段）。Alexa Fluor 647アルパカ抗ウサギIgGナノ二次抗体（SA510327）で標識した抗β-アクチン（左側）と抗LaminB1（右側）ウサギ一次抗体。縮尺スケールバー、20 μm。

Alexa Fluor 647抗マウスIgG2b、Alexa Fluor 488抗マウスIgG1、およびAlexa Fluor 568抗ウサギIgGによるHeLa 細胞の多重免疫染色

図7.3つのAlexa Fluorアルパカナノ二次抗体によるHeLa細胞のマルチプレックスイメージング。Alexa Fluor 488ナノ抗マウスIgG1ナノ二次抗体（緑色）（SA510329）で標識したマウスIgG1抗COX4一次抗体。 Alexa Fluor 647抗マウスIgG2bナノ二次抗体（紫色）（SA510339）で標識したたマウスIgG2b 抗チューブリン一次抗体。 Alexa Fluor 568抗ウサギIgGナノ二次抗体（黄色）（SA510325）で標識したウサギ抗Lamin一次抗体。縮尺スケールバー、10 μm。

図8.HeLa細胞の免疫染色。Tubulin-GFPを安定的に発現している細胞を、ウサギ抗GFP PABG1抗体およびAlexa Fluor 647抗ウサギIgGナノ二次抗体（SA510327）で染色しました。縮尺スケールバー、10 μm。

図9.免疫染色したHeLa細胞の共焦点およびゲートSTED画像。細胞をウサギ抗Lamin B1抗体で染色し、Alexa Fluor 568アルパカ抗ウサギIgGナノ二次抗体で標識しました。画像は、Leica TCS SP8 STED 3X顕微鏡、775 nmレーザーによるパルス除去により取得しました。

図10.HEK293T細胞ライセート中の内在性ß-チューブリンのウェスタンブロット解析。HEK293T細胞ライセートを、マウス抗ß-チューブリン一次抗体でß-チューブリンに対してプローブしました。標識にはAlexa Fluor 647アルパカ抗マウスIgG2bナノ二次抗体を使用しました。

Alexa Fluor 647二次ナノボディを使用したマルチプレックス蛍光ウェスタンブロット解析

図11.マルチプレックス蛍光ウェスタンブロッティングに適用した複数のAlexa Fluorアルパカナノ二次抗体。同じブロット上で同時分析した複数のターゲット。HEK293T細胞ライセート中のGFP-TOM70、ß-チューブリン、およびGFPのマルチプレックス蛍光ウェスタンブロット。ウェスタンブロットメンブレンを一次抗体およびナノ二次抗体で同時にインキュベーションしました。緑色：Alexa Fluor 488抗ウサギIgGナノ二次抗体で標識したウサギ抗GFP。赤紫色：Alexa Fluor 647アルパカ抗マウスIgG2bで標識したマウス抗ß-チューブリン。