リキッドバイオプシーを用いた臨床研究のための Oncomine Cell-Free research Assay

血液サンプルから変異の検出結果までを包括した、セルフリー核酸のためのリキッドバイオプシーワークフロー

Ion Torrent Oncomine cell-free research Assay は、血漿中の体細胞変異を、固形腫瘍に関連する遺伝子変異の 0.1％まで再現性よく検出できるマルチバイオマーカー次世代シーケンシング（NGS）アッセイです。リキッドバイオプシー NGS ワークフローの一部として使用した場合、研究用血液試料採取から変異検出結果の取得までにかかる時間はわずか 2 日間です。

各アッセイには、ライブラリ作製用の試薬と、全血の血漿画分に認められるセルフリー DNA（cfDNA）およびセルフリー RNA（cfRNA）からアンプリコンライブラリを調製するためのマルチプレックス PCR に使用するプライマープール1本が含まれており、それぞれのアッセイはセルフリー核酸から腫瘍由来 DNA および RNA を検出するための研究ソリューションの一部分を担います。

このアッセイは、1 本の血液チューブから臨床研究に用いられるがんサンプル中で頻繁に認められる一塩基置換、短い挿入欠失、コピー数変異および融合遺伝子を解析するためにデザインされています。このアッセイにより、検出限界（LOD）を 0.1％まで下げることができます。

フライヤー

Analytical Validation of the Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay

ホワイトペーパー：Oncomine Pan-Cancer Cell-Free research アッセイのアナリティカルバリデーション

評価済みの市販標準物質および臨床血漿サンプルに対してこのアッセイがどのように機能するかご覧ください。

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なぜ病理医と腫瘍医はリキッドバイオプシーによる臨床がん研究に関心があるのですか？

リキッドバイオプシーは、従来の固形腫瘍サンプルを用いる手法と比べ、以下の利点があります。

採取時の侵襲性が低いため、腫瘍を含む試料の複数回採取が期待できる
組織サンブルを用いる従来法と比較して価格を抑えられる
サンプル採取から結果取得までの所要時間を短縮する
腫瘍の不均一性の理解を手助けする
将来的な臨床研究とその応用につながる可能性がある

私たちは現在、がんが分子病であることを知っています。将来のがん研究をより良好に進めていくために、がん遺伝子と腫瘍性タンパク質が時間と空間の両方において、どのように変化するのか、より明確に理解する必要があります。リキッドバイオプシーを用いたアプリケーションにより、臨床研究者は以前不可能だった方法で腫瘍を調べることができます。

以前は、cfDNA を用いた臨床がん研究の分野では、デジタル PCR やドロップレットデジタル PCR アプリケーションを用いることで低頻度変異を有するサンプルを解析することに主眼が置かれていました。これらの手法は高感度ではありますが、ターゲット遺伝子の絶対数が制限されるため、研究者の視野を狭めることがあります。

Oncomine cell-free research Assay および Ion GeneStudio S5 システムにより、腫瘍の不均一性研究、治療選択研究、治療モニタリング研究、再発研究の調査を、わずか 1 ng のサンプルインプット量から実施することができます。

EGFR T790M などの変異を検出します

「Oncomine Lung cfDNA Assay を使用して、これまで難しかったサンプルを増幅することができました。このアッセイで、EGFR T790M などの変異を 0.14％のアレル頻度まで検出できました。」

ポルト大学（ポルトガル）分子病理学・免疫学研究所の
上級研究員
José Luis Costa博士

セルフリー核酸中の主要なドライバー（促進因子）変異と耐性変異に重点をおいたリキッドバイオプシーによる臨床研究用に最適化されています

Oncomine cell-free research Assay には、がんゲノミクスデータリソースである Oncomine Reporter によって特定され、臨床研究者が精査したターゲット遺伝子が含まれています。

Oncomine cell-free research Assay の遺伝子コンテンツ

アッセイ	DNA／RNA	遺伝子		対象となる SNV ホットスポット	CNV	融合遺伝子	それ以外のもの
Oncomine Pan-Cancer Cell-Free Assay	DNA & RNA	AKT1 ALK APC AR ARAF BRAF CCND1 CCND2 CCND3 CDK4 CDK6 CHEK2 CTNNB1 DDR2 EGFR ERBB2 ERBB3 ERG ESR1 ETV1 FBXW7 FGFR1 FGFR2 FGFR3 FGFR4 FLT3	GNA11 GNAQ GNAS HRAS IDH1 IDH2 KIT KRAS MAP2K1 MAP2K2 MET MTOR MYC NRAS NTRK1 NTRK3 PDGFRA PIK3CA PTEN RAF1 RET ROS1 SF3B1 SMAD4 SMO TP53	以下を含む 900 超のホットスポット BRAF EGFR HRAS、KRAS、NRAS	CCND1 CCND2 CCND3 CDK4 CDK6 EGFR ERBB2 FGFR1 FGFR2 FGFR3 MET MYC	ALK BRAF ERG ETV1 FGFR1 FGFR2 FGFR3 MET NTRK1 NTRK3 RET ROS1	MET エキソン 14 スキッピングがん抑制遺伝子： APC FBXW7 PTEN TP53
Oncomine Lung cfTNA Assay	DNA & RNA	ALK BRAF EGFR ERBB2 KRAS MAP2K1 MET NRAS PIK3CA RET ROS1 TP53		以下を含む 150 超のホットスポット EGFR：T790M、C797S、 L858R、エキソン 19 del KRAS：G12X、G13X、Q61X BRAF：V600E ALK：エキソン 21-25 PIK3CA：E545K、H1047R、E542K	MET	ALK、RET、ROS1	MET エキソン 14 スキッピング
Oncomine Lung cfDNA Assay	DNA	ALK BRAF EGFR ERBB2 KRAS MAP2K1 MET NRAS PIK3CA ROS1 TP53		以下を含む 150 超のホットスポット EGFR：T790M、C797S、L858R、エキソン 19 del KRAS：G12X、G13X、Q61X BRAF：V600E ALK：エキソン 21-25 PIK3CA：E545K、H1047R、E542K	---	---	---
Oncomine Breast cfDNA Assay v2	DNA	AKT1 CCND1 EGFR ERBB2 ERBB3 ESR1 FBXW7 FGFR1 KRAS PIK3CA SF3B1 TP53		以下を含む 150 超のホットスポット PIK3CA：E545K、H1047R AKT1：E17K ESR1：抗エストロゲン耐性関連変異 TP53：機能喪失関連変異 ERBB2：抗 ERBB2 療法感受性に関連する変異	CCND1、ERBB2、 FGFR1	---	TP53 のカバレッジの拡大
Oncomine Breast cfDNA Assay	DNA	AKT1 EGFR ERBB2 ERBB3 ESR1 FBXW7 KRAS PIK3CA SF3B1 TP53		以下を含む 150 超のホットスポットPIK3CA：E545K、H1047R AKT1：E17K ESR1：抗エストロゲン耐性関連変異 TP53：機能喪失関連変異 ERBB2：抗 ERBB2 療法感受性に関連する変異	---	---	---
Oncomine Colon cfDNA Assay	DNA	AKT1 APC BRAF CTNNB1 EGFR ERBB2 FBXW7 GNAS KRAS MAP2K1 NRAS PIK3CA SMAD4 TP53		以下を含む 240 超のホットスポット KRAS/NRAS：G12/G13/Q61 BRAF：V600E PIK3CA：E545K、H1047R TP53：R175H R273H/C/L 再発性の APC 病的変異（p.R876、p.R1114、p.Q1378、p.R1450など）SMAD4：R361C/H CTNNB1：S45F、T41A	---	---	---

ホットスポット遺伝子		がん抑制遺伝子	コピー数変異遺伝子	融合遺伝子
AKT1 ALK AR ARAF BRAF CHEK2 CTNNB1 DDR2 EGFR ERBB2 ERBB3 ESR1 FGFR1 FGFR2 FGFR3 FGFR4 FLT3 GNA11 GNAQ GNAS	HRAS IDH1 IDH2 KIT KRAS MAP2K1 MAP2K2 MET MTOR NRAS NTRK1 NTRK3 PDGFRA PIK3CA RAF1 RET ROS1 SF3B1 SMAD4 SMO	APC FBXW7 PTEN TP53	CCND1 CCND2 CCND3 CDK4 CDK6 EGFR ERBB2 FGFR1 FGFR2 FGFR3 MET MYC	ALK BRAF ERG ETV1 FGFR1 FGFR2 FGFR3 MET NTRK1 NTRK3 RET ROS1

Oncomine cell-free Assay は、 Ion Torrent シーケンシングを活用することで研究者が新たなアプリケーションを開発できるようにします

1 本の血液チューブ—1 本の血液チューブからの実験を可能とする 2 日間の NGS ワークフロー
有用なコンテンツ—OncoNetwork コンソーシアムや業界の専門家が選択し検証した重要なターゲットが含まれており、あらゆる種類の重要な変異（SNV、挿入欠失、CNV、融合遺伝子）を解析することができる
サンプルの許容性—インプット量の柔軟性と変動に対する許容性があるため、幅広い目的のサンプルに適用できる
低い検出限界—SNV ホットスポット変異および挿入/欠失の検出下限値は 0.1％
コストの削減—腫瘍タイプ特異的なアンプリコンのカバレッジが均一なため、シーケンシング1ランで多くのサンプルを処理できる
最適化された解析—感度と特異性を高めたバリアントコール

より多くのリキッドバイオプシー研究サンプルから結果を得ることができます

セルフリー核酸量はサンプルごとに異なるため、特に少量の場合をサポートするうえでインプット DNA 量に対する柔軟性は不可欠です。Oncomine cell-free Assay はさまざまなインプット量をサポートすることができます（図 1）。できるだけ多くのサンプルからデータを取得することは、リキッドバイオプシー研究を進めるうえで重要なステップです。

oncomine-cell-free-dna-assays-liquid-biopsy-clinical-research-fig-2-sml

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図 1.アンプリコンカバレッジとインプット DNA 量により、Oncomine cfDNA Assay を用いた検出限界値が決まります。

検証試験において、本アッセイでは、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルで判定されたバリアントと血漿で判定されたバリアントの高い相関が示されています（表 1）。予想どおり、FFPE 腫瘍サンプルでは、血漿で測定したものと比較して、より高い変異アレル頻度になっており、生殖細胞変異は、FFPE および血漿の両方で約 50％の予測レベルで認められました。

サンプル	バリアント	FFPE	血漿
1	EGFR-L858R	71.42％	2.62％
2	TP53-R158L	51.89％	4.32％
3	MET-T1010I KRAS-G12C	43.87％ 34.62％	51.57％ 0.28％
4	N/A	検出なし	検出なし
5	EGFR-L858R MET-T1010I TP53-Y220C	58.44％ 41.93％ 35.54％	7.28％ 48.72％ 1.93％
6	TP53-R158L	10.19％	1.26％

表 1.FFPE と一致した血漿サンプルの結果との相関（末期肺がんサンプル）。Oncomine cell-free Assay では、FFPE サンプルで判定されたバリアントと、一致した血漿サンプルで判定されたバリアントとの高い相関が示されています。上記のデータは、Oncomine Lung cfDNA Assayを使用して得られました。太字の値は体細胞変異を示します。太字でない値は生殖細胞変異を示します。

総じて、Oncomine cell-free Assay はより多くのサンプルから結果を得ることができ、臨床研究サンプルを使用した実証例でも、0.1％の検出限界値、感度 90％および特異度 98％を超えるデータが Oncomine cell-free Assay の製品群全体にわたり再現良く得られています。

サンプル	*EGFR* E746_A750delELREA	*EGFR* L858R	*EGFR* T790M	*EGFR* V769_D770insASV	*KRAS* G12D	*NRAS* A59T	*NRAS* Q61K	*PIK3CA* E545K
0.1％ HDX	0.06	0.17	0.06	0.10	0.22	0.17	0.15	0.10
1％ HDX	0.72	1.07	0.75	0.74	1.14	1.15	1.15	2.29
5％ HDX	4.52	4.86	6.32	3.97	6.34	6.11	6.94	5.29
100％ WT	0	0	0	0	0	0	0	0

表 2.Horizon cfDNA Multiplex Reference Set で検出されたバリアント。八つのホットスポット変異は、すべて 0.1％で検出されました。Oncomine Lung cfDNA Assay を使用して得られたデータ。

Oncomine cell-free research ワークフロー

Ion 530 チップで最大 8 サンプル、または Ion 540 チップで最大 32 サンプルを同時に処理します（Oncomine Lung cfDNA Assay の場合）。Oncomine cell-free Assay は、効率的なマルチプレックスPCRにより、一般的な腫瘍タイプで頻繁に認められる一塩基置換（SNVs）、短い挿入欠失、コピー数変異、融合遺伝子の解析を可能にします。Oncomine cell-free Assay の全製品群にわたり、サンプルインプット量が 1 ng という低いインプット量の場合でも柔軟に対応します。

推奨する Applied Biosystems MagMAX Cell-Free Isolation Kit を使用したセルフリー核酸の単離からサンプルの解析までのワークフロー全体（図 2）は、Ion GeneStudio S5 Prime システムでは、わずか 2 日で完了します。

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調製

セルフリー核酸の単離（MagMAX Cell-Free Isolation Kit）
ライブラリ調製（Oncomine Cell-Free Assay）
テンプレート調製（Ion Chef System）

シーケンス

ハイスループットシーケンシング（Ion GeneStudio S5 シリーズ）

解析

バリアントコーラーによる最適化された解析（Torrent Suite／Ion Reporter Software）
ラベル、ガイドラインおよび国際共同治験（Oncomine Reporter）

リキッドバイオプシー臨床研究に必要なすべてのツール

Oncomine cell-free Assay は、リキッドバイオプシー臨床研究用にデザインされた完全なワークフローの一部です。

Oncomine cell-free Assay

キットには、ライブラリ構築用の試薬と、全血の血漿画分に含まれるセルフリー核酸からアンプリコンライブラリを調製するためのマルチプレックス PCR 用プライマープールが1本含まれます。

Tag Sequencing Barcode Set 1–24 および 25–48

弊社の機器で最適な性能を発揮するよう特別にデザインされたユニークなバーコードアダプターのセット。このユニークなバーコードアダプターは、Ion GeneStudio S5 シリーズおよび Ion PGM と互換性があります。このセットは、キットと組み合わせて使用すると、最大 24 のアンプリコンライブラリをプールし、マルチプレックスシーケンシング解析を実行できるため、サンプルあたりのシーケンシングコストを削減できます。

Ion GeneStudio S5 シリーズ

Ion GeneStudio S5 シリーズは最大 5 種類の半導体チップをサポートしているため、1 台のシーケンサーで複数のアプリケーションを実行できます。この柔軟性により、サンプルをバッチ処理する必要がないため、最適なコスト効率が得られます。必要となるスループットまたはアプリケーションに最適なチップタイプをお選びください。

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ポスター：血漿サンプルで本当に包括的な遺伝子変異評価ができますか？

詳細については、AACR 2019 で発表されたこのポスターをご参照ください。