Streptavidin—signal amplification for imaging

検出感度の向上のためには、ストレプトアビジンベースの増幅技術が蛍光イメージングにおいて広く使用されており、一次抗体および二次抗体、リガンド、さらには毒素またはin situハイブリダイゼーションにおけるDNAプローブなどの検出がストレプトアビジンを介して行われています。

ストレプトアビジンベースの検出は、中量から少量のターゲット用に、シンプルなワークフローによるシグナル増幅を提供します。

ビオチン結合性タンパク質には、ストレプトアビジン、アビジンおよびNeutrAvidin® タンパク質が含まれ、それぞれ1分子のタンパク質に4個のビオチンが高親和的かつ高選択的に結合しています。最も一般的に使用されているのはストレプトアビジンで、グリコシル化されておらず、結合の度合いは低くなっています。アビジンは高度に陽イオン性の糖タンパク質であり、等電点は約10.5です。アビジンの正に荷電した残基およびオリゴ糖組成は非特異的に反応する可能性があり、いくつかのアプリケーションにおいてはバックグラウンドの問題を生じることがあります。NeutrAvidin® タンパク質には、糖部分を排除して等電点を低下させる処理が施されているため、バックグラウンド染色が低減されます。

ストレプトアビジンベースの増幅の使用が勧められるケース。

Molecular Probes®では、蛍光イメージングのための完全な一連の検出技術をご提供しています。この一連のツールを使用することにより、適切な検出波長において、ターゲットの量に最適な技術を選択し、補完検出波長を使用することにより、マルチプレックス解析を行うことが可能となります。

  • 多量のターゲット—一次標識、増幅不要
  • 中量のターゲット—二次標識、中等度の増幅
  • 中量から少量のターゲット—ストレプトアビジンコンジュゲート、シグナルの増幅が必要
  • 少量のターゲット—酵素増幅等、シグナル増強のための複雑なプロセスが必要
 

内在性ビオチンのブロッキング

哺乳類細胞および組織は様々な代謝機能が必要とされるため、ビオチン依存性のカルボキシラーゼを含んでいます。ビオチン-ストレプトアビジンまたはビオチン-アビジン検出系が細胞ターゲットの同定のために使用される場合には、これらのビオチン含有酵素は、しばしば非常に大きなバックグラウンドシグナルを発生します。内因性のビオチンは、ミトコンドリア、腎臓、肝臓および脳組織中に特に多く存在します。

Endogenous Biotin-Blocking キットは、高レベルの内因性ビオチンを含む細胞または組織中のターゲットの同定でビオチン-ストレプトアビジン検出系が使用される場合に、バックグラウンドのシグナルを低減させるために有用です。

図1.ゴルジ体をターゲットとしたAlexa Fluor® 488 ストレプトアビジンは、内因性のビオチンとも結合し（左）、非特異的ラベリングを生じます  Endogenous Biotin-Blocking キットは非特異的ラベリングおよび緑色バックグラウンドシグナルを低減させます（右）。

ストレプトアビジンコンジュゲートの選択方法

ストレプトアビジンは、様々な蛍光色素とコンジュゲートされ、幅広い種類のターゲットのイメージングに使用されます。大部分のスタンダードなプロトコルでは、従来の色素コンジュゲートが使用されており、幅広い波長でターゲットのイメージングを行うことができます。Alexa Fluor® コンジュゲートは、スタンダードのライトキューブまたは波長設定において、明るいシグナルおよび光退色への抵抗性を提供します。Qdot® コンジュゲートは、直接イメージングにおいて、ほとんどまたは全く光退色のない、最も輝度の高いシグナルを提供します。

 

  Qdot® コンジュゲート AlexaFluor® コンジュゲート スタンダード色素コンジュゲート
スタンダード光キューブまたはフィルターによる最適なシグナル 
光退色に対する抵抗性
幅広い範囲の波長
至適化されたフィルターによる究極の輝度  
細胞表面および細胞質ターゲット
核ターゲット 

輝度および光退色のためのQdot® コンジュゲート

 Qdot® コンジュゲートは長時間のプロトコルを使用しても、直接イメージングにおいて、ほとんどまたは全く光退色のない、最も輝度の高いシグナルを提供します。Qdot® プローブの観察にはスタンダードのライトキューブまたはフィルターを使用することが可能ですが、最適なシグナル強度を達成するためには、特別なフィルターが必要です。Qdot® コンジュゲートは、細胞表面および細胞質ターゲットのトラッキングのために、強度の高いシグナルを提供し、核ターゲットはAlexa Fluor® 色素などの有機蛍光色素によってより効果的にイメージングされます。

高感度イメージング用のAlexa Fluor ® コンジュゲート

 AlexaFluor® ストレプトアビジンコンジュゲートは、スタンダードの顕微鏡設定、ライトキューブまたはフィルターを使用して、輝度および光安定性を提供します。Alexa Fluor® 色素の蛍光スペクトルは、可視および赤外範囲をカバーし、マルチプレクシングが容易です。イメージングおよび解析において、これらの有機蛍光色素は、核および細胞質のいずれへも容易に透過します。

ルーチンな解析のための従来の色素コンジュゲート

 フルオレセイン（FITC）、テトラメチルローダミン（TRITC）およびTexas Red® は、ビオチン結合性タンパク質にコンジュゲートし、スタンダードプロトコルによって核および細胞質ターゲットの幅広い波長範囲でのイメージングを可能とします。従来の色素コンジュゲートは、最高の輝度および光安定性が必須ではない場合に、比較的大量のターゲットの解析に最適です。

イメージング アクセサリ

固定した細胞および組織において、当社の蛍光ストレプトアビジンコンジュゲートを使用した、最適な蛍光免疫染色によるイメージングを行うためには、当社でご提供しているImage-iT® FX キット で必要なすべての試薬が揃います。

各キットには50～100のアッセイを行うために十分な、以下の構成品が含まれています。

 

リソース