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少量ターゲット用のチラミドシグナル増幅
Invitrogen SuperBoostチラミドシグナル増幅キットおよび試薬は、優れたシグナル増幅用に特別に設計されており、低存在量のターゲットのイメージングに必要なシグナルの鮮明度をさらに向上させることができます。SuperBoost試薬はInvitrogen Alexa Fluor色素の高輝度性能を、ポリHRP介在チラミドシグナル増幅と組み合わせており、標準的な処理や他のチラミドシグナル増幅試薬と比較して、一般的に2～10倍高い感度を実現します。これは免疫組織化学、FISH、およびその他のマルチプレックス イムノフェノタイピングに特に有用です。
チラミドシグナル増幅はどのように機能しますか？
チラミドシグナル増幅プロセスには、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）を使用して、一次抗体が標的とするタンパク質エピトープ上およびその周辺にチロシン残基を酵素的に結合させる方法が含まれます。制御された酵素反応であるため、チラミドシグナル増幅は酵素活性部位から拡散しないため、HRPまたはアルカリホスファターゼベースの方法に比べて空間分解能が向上します。
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図1.SuperBoostチラミドシグナル増幅システムの図。抗原は一次抗体（青色）で検出され、続いてポリホースラディッシュペルオキシダーゼ（ポリ-HRP）コンジュゲート二次抗体（黄色）で検出されます。HRPによる色素標識チラミド（緑色）の活性化により、活性化チラミド誘導体（ピンク色）の局所的な沈着が生じます。
SuperBoostチラミドシグナル増幅とは何ですか？
IHC、空間プロテオミクス、およびその他のマルチプレックスイメージング実験の制限は、非特異的結合のための低存在量タンパク質および自己蛍光の検出です。SuperBoost Tyramideキットおよび試薬は、増幅方法としてポリHRP標識二次抗体を使用します。複数のHRPを持つ抗体は、組織の浸透を損なうことなくシグナルを増強します。
利点
- 低存在量で検出が困難なターゲットに対応する高感度蛍光イメージング検出法です
- 標準フィルターおよび顕微鏡に適合するシグナルを生成する使いやすいキット
- 高分解能の画像が得られ、蛍光タンパク質・DAPI・二次抗体・SuperBoostキット各種製品とのマルチプレックスに対応します
図2.SuperBoost Tyramideキットおよびポリ-HRP付き試薬は、より長い時間、より明るいシグナルを示します。HeLa細胞をさまざまな濃度のanti-prohibitin抗体でインキュベートし（メーカー推奨希釈倍率；1：150希釈、または終濃度5 µg/mL）、（1）Invitrogen Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost Kit（ヤギ抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 488 Tyramide）、（2）当社のオリジナルのInvitrogen TSA Kit #12（ヤギ抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 488 Tyramide）、（3）Invitrogen F(ab′)2ウサギ抗ヤギIgG（H+L）二次抗体）の試薬で標識しました。Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System（see information about EVOS imaging systems）を使用して、（同じ露光とゲインを使用して）細胞画像を取得しました。これらの画像は、Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost Kitが、当社のオリジナルのTSAキットまたは直接標識した二次抗体よりも高い感度で検出できることを示しています。
SuperBoostチラミドシグナル増幅の使用方法
SuperBoost チラミドシグナルキットは、単独で、または他の試薬や蛍光色素と組み合わせて使用するのが簡単です。このワークフローでは、蛍光色素標識二次抗体は、ポリHRPと結合した二次抗体を含むSuperBoostチラミドシグナル増幅に置き換えられます。さらに、2～10分間コンジュゲートチラミドとインキュベーションし、特定のシグナルが検出された後にHRP活性を停止するための停止液を添加するだけです。さらに、停止液は蛍光シグナルの特異性と分解能を維持するのに役立ちます。SuperBoostチラミドシグナル増幅キットは、標準的なICC、IHC、FISHで使用されるワークフローと同様のシンプルなワークフローを提供します。
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図3.SuperBoostチラミドシグナルキットのワークフロー。これは6ステップまたは7ステップのプロセスで、クリアで明るいシグナルを提供するように最適化できます。このワークフローでは、他の蛍光試薬および二次抗体蛍光色素の添加ポイントを示します。
タンパク質発現の検出 は、一次クローンおよび二次検出法に依存します。SuperBoostチラミドシグナルを使用して、微量タンパク質を同定するシグナルを増幅する必要があります。当社は、さまざまなタンパク質の存在を検出するのに役立つ幅広い検出技術を提供しています。
- 量の多いターゲット—一次コンジュゲート、増幅不要。
- 中程度の存在量のターゲット—二次的コンジュゲート、適度な増幅。
- 中～低程度の存在量のターゲット—ストレプトアビジンコンジュゲート、有意なシグナル増強。
- 低存在量ターゲット—シグナルの増強を最大化する酵素増幅。
適切な検出技術を選択するには、免疫蛍光ガイドをご覧ください。
IF、IHC、FISHにおけるSuperBoostチラミドベースの増幅の例
SuperBoostチラミドシグナルキットは、他のさまざまなマーカー検出および細胞染色技術と互換性があり、マルチプレックス実験や蛍光共局在研究を可能にします。SuperBoostチラミドシグナルキットは、標準的なICC、IHC、およびFISH法で一般的に使用される細胞タイプおよび蛍光イメージングシステムに使用できます。当社は、2Dおよび3D培養、FFPE組織、および凍結切片組織におけるホルムアルデヒド固定細胞株を使用したSuperBoostチラミドシグナルキットの性能を試験しました。
SuperBoostチラミドシグナル試薬のマルチプレックス化は、以下の方法で実現できます。
- DAPIなどの対比染色用蛍光マーカー
- 蛍光タンパク質（GFP＆RFPなど）
- 標準ICC／IHC
- その他のSuperBoostチラミドシグナルキット
IHCおよびFFPEサンプル
サンプルタイプ：ラット腸切片（FFPE）。
抗体：H2B、アクチンおよびKi-67に対する3つの一次抗体を用いて、連続的に免疫標識を行いました。
メソッド：各抗体標識の間、サンプルをクエン酸バッファーpH 6で沸騰するまで電子レンジなどで加熱（～2分）し、20%の出力で15分間加熱した後、室温まで冷却してからウサギ抗体で標識しました。サンプルは、抗H2BをAlexa Fluor 647 Tyramide SuperBoost Kit（緑色）で、ウサギ抗平滑筋アクチン抗体（Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost Kit（赤色）で検出）、ウサギ抗Ki67抗体（Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost Kit（青色）で検出）の3種類の一次抗体で標識しました。
細胞培養におけるICC
サンプルタイプ：固定および透過化されたHeLa細胞。
抗体：抗ATP合成酵素抗体および抗βカテニン抗体に対する3つの一次抗体を用いて、連続的に免疫標識を行いました。
メソッド：細胞を抗ATP合成酵素抗体 とAlexa Fluor 594標識二次抗体で標識しました。さらに、細胞をanti–β-catenin antibody とともにインキュベーションし、Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost Kit（ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa Fluor 488 Tyramide）で標識しました。核をNucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagentで標識しました。画像は共焦点顕微鏡で撮影しました。
FISHや細胞培養
サンプルタイプ：固定および透過化されたU2OS細胞。
抗体：抗Cas9抗体で免疫標識し、hprt遺伝子を標的とするオリゴでプローブしました。
メソッド：U2OS細胞を固定して透過処理し、hprt遺伝子プローブと非活性Cas9タンパク質でインキュベートしました。HPRTプローブは、sg-RNAを含むCas9認識用に設計されています。hprt遺伝子座で組み立てられたCas9タンパク質およびhprtプローブ複合体を検出するために、抗Cas9抗体を使用しました。この一次抗体は、hprt遺伝子座を特異的に検出するAlexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost Kit（ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa Fluor 488チラミド）により検出されました。核をNucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagentで標識しました。画像はEVOS FL Auto Imaging Systemで取得および分析しました（see information about EVOS imaging systems）。
標準ICC／IHC
サンプルタイプ：固定および透過処理されたHeLa培養細胞。
抗体：抗ATP合成酵素サブユニットIF1抗体で細胞を免疫標識しました。
メソッド：Image-iT Fixation/Permeabilization Kitを使用して固定および透過処理したHeLa細胞を、抗チューブリン一次抗体およびAlexa Fluor 488 goat anti–mouse IgG (H+L) Secondary Antibodyとともにインキュベーションしました。次に細胞をAnti–ATP Synthase Subunit IF1 Antibodyとともにインキュベーションし、Alexa Fluor 594 Tyramide SuperBoost Kit（ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa Fluor 594 Tyramide）に含まれる試薬で標識しました。核をNucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagentで標識しました。画像は共焦点顕微鏡で撮影しました。
別のSuperBoost Kitの共使用
サンプルタイプ：固定および透過処理されたHeLa培養細胞。
抗体：HeLa細胞をanti-prohibitin抗体で免疫標識しました。
メソッド：Image-iT Fixation/Permeabilization Kitの試薬を使用して処理した固定および透過化HeLa細胞をanti-prohibitin抗体でインキュベートし、Alexa Fluor 647 Tyramide SuperBoost Kit（ヤギ抗ウサギIgGおよびAlexa Fluor 647チラミド）の試薬で標識しました。さらに、細胞をanti–β-catenin とともにインキュベーションし、Alexa Fluor 488 Tyramide SuperBoost Kit（ヤギ抗マウスIgGおよびAlexa Fluor 488 Tyramide）に含まれる試薬で標識しました。核をNucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagentで標識しました。画像は共焦点顕微鏡で撮影しました。
Ordering information
Tyramide SuperBoostキットのご注文情報
| 標識チラミド（Ex／Em） |
Tyramide SuperBoost Kit*
| ||
|---|---|---|---|
抗マウスIgG（宿主：ヤギ）
|
抗ウサギIgG（宿主：ヤギ）
|
ストレプトアビジン
| |
| Alexa Fluor 488（495／519 nm） | B40912 B40941（50カバースリップ） | B40922 B40943（50カバースリップ） | B40932 |
| Alexa Fluor 555（555／565 nm） | B40913 | B40923 | B40933 |
| Alexa Fluor 594（591／617 nm） | B40915 B40942（50カバースリップ） | B40925 B40944（50カバースリップ） | B40935 |
| Alexa Fluor 647（650／668 nm） | B40916 | B40926 | B40936 |
| Biotin-XX | B40911 | B40921 | B40931 |
| * 特に明記されていない限り、最大150枚の18 mm x 18 mmカバースリップに十分な材料が提供されています（もっとも重要なインキュベーションステップで150 µ Lを使用する場合）。各種サンプルサイズに応じて、容量の調整が可能です。 | |||
スタンドアローン型Tyramide SuperBoost試薬のご注文情報
SlowFade褪色防止用封入剤のご注文情報
TSA試薬でのストリッピングおよび再プロービングには、SlowFade褪色防止用封入剤をご使用ください。
SuperBoostチラミドシグナルおよびストリッピングや再染色などのアプリケーション用のプロトコル
関連リソース
詳細な使用法が記載された出版物の一部
- Avens HJ, Berron BJ, May AM, Voigt KR, Seedorf GJ, Balasubramaniam V, Bowman CN.Sensitive immunofluorescent staining of cells via generation of fluorescent nanoscale polymer films in response to biorecognition.J Histochem Cytochem.2011 Jan;59(1):76-87.PMID: 21339175 .
- Kosmac K, Peck BD, Walton RG, Mula J, Kern PA, Bamman MM, Dennis RA, Jacobs CA, Lattermann C, Johnson DL, Peterson CA.Immunohistochemical Identification of Human Skeletal Muscle Macrophages.Bio Protoc.2018 Jun 20;8(12):e2883.PMID: 30148186 .
- Tóth ZE, Mezey E. Simultaneous visualization of multiple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species.J Histochem Cytochem.2007 Jun;55(6):545-54.PMID: 17242468 .
リソース
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「5ステップ」リソース
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